Độc lực gây chết rệp của bào tử nấm được đánh giá theo phương pháp của Abbott (1925) [4]:
+ LT50 (Lethal Time) là thời gian cần thiết để bào tử nấm gây chết 50% số lượng rệp. Giá trị LT50 càng nhỏ thì độc lực của bào tử nấm đối với rệp càng mạnh.
+ Độc lực gây chết rệp của bào tử nấm được tính theo cơng thức:
Kết quả sau đó được xử lí bằng phần mềm Microsoft office excel và phần mềm thống kê SAS.
Khả năng gây chết rệp của bào tử nấm (%)
Phần trăm (%) rệp sống sót ở lơ thí nghiệm Phần trăm (%) rệp sống sót ở lơ đối chứng
2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử
Tách chiết DNA tổng số: Nấm 485 được nuôi cấy 96 giờ trong môi trường
PDA ở 30C, lắc 150 vịng/phút. Dịch ni được ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa sợi nấm được nghiền nhẹ trong nitơ lỏng rồi bổ sung 600 µl đệm phá tế bào, lắc nhẹ, bổ sung tiếp 65 µl dung dịch lysozyme, ủ 37°C trong 45 phút. Hỗn hợp sau đó được bổ sung 5 µl dung dịch protease K, ủ 2-3 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform/isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1, để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C được làm khô dưới ánh sáng đèn sợi đốt và được bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa được làm khơ và hịa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở -20°C.
Khuếch đại gene bằng PCR: Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng
nấm 485, cặp mồi NL1-F (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và NL4-R (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') được sử dụng.
Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 1,5 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl đệm PCR 10x; 0,25 µl Taq; 1 µl khn DNA và bổ sung H2O cất tiêm lên tổng thể tích 25 µl.
Phản ứng được thực hiện ở điều kiện: 95°C/4 phút, 35 chu kỳ (95°C/1 phút; 53°C/1 phút; 72°C/1 phút); 72°C/10 phút.
Gắn sản phẩm PCR vào pJET1.2: Ủ hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản
phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở 22°C.
Biến nạp plasmid: Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5
theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phương pháp là E. coli được xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các lỗ màng tế bào mở rộng làm các chuỗi DNA đi vào dễ dàng.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được nuôi trong 2 ml LB lỏng,
lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Nuôi lắc tiếp giống 1% ở 37°C trong 2-3 giờ đạt OD600nm 0,4-0,7. Dịch nuôi cấy để lạnh 30 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 5000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào được ủ lần 1 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong 1 giờ, ly tâm thu tế bào. Rửa lần 2 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong 20 phút. Tế bào đã qua xử lý được hòa trong 100 l dung dịch 0,1 M CaCl2 để chuẩn bị biến nạp.
Các thao tác được thực hiện ở điều kiện 4°C.
Biến nạp plasmid vào E. coli: tế bào khả biến tươi hoặc lấy từ -80°C đã để
30 phút trong đá. Hút 40 µl dịch tế bào khả biến và 5 µl dung dịch nối ghép gene vào một ống eppendorf mới, đảo nhẹ nhàng rồi ủ trong đá 30 phút. Sau đó, hỗn hợp được sốc nhiệt 42°C trong 45 giây, lấy mẫu ra và đặt 5 phút trong đá. Bổ sung 250 µl mơi trường LB lỏng và ni lắc 200 vịng/phút ở 37°C trong 1 giờ. Cấy trải 100 µl dịch ni trên đĩa LB bổ sung ampicilin (100 µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm.
Tách chiết plasmid: Mỗi khuẩn lạc đã được biến nạp mọc trên đĩa thạch được nhặt cấy vào 1,5 ml môi trường LB chứa ampicillin (100 µg/ml), ni lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tủa tế bào thu được sau khi ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút được bổ sung 150 µl Sol I rồi lắc rung 30 giây tạo thành dịch đồng nhất. Ủ dịch 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, bổ sung 150 µl Sol II rồi đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp và đảo nhẹ. Hỗn hợp được bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 12500 vòng/phút trong 10 phút. 450 µl pha trên được hút sang ống eppendorf mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa plasmid. Tủa plasmid thu được sau khi ly tâm 12500 vòng/phút trong 5 phút được rửa bằng 500 µl ethanol 70% ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng. Tủa plasmid được hòa trong đệm TE pH 8 hoặc nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C.
Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn: Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có
mang sản phẩm mong muốn hay khơng, plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc được cắt bằng cặp enzyme giới hạn XhoI và XbaI qua đêm ở 37C. Hỗn hợp phản ứng
gồm 3 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,5 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango Y+ và bổ sung nước cất tiêm đến 10 µl. Sản phẩm cắt được điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra.
Đọc trình tự nucleotide: Sau khi plasmid tái tổ hợp được tinh sạch, đoạn DNA chèn vào plasmid được đọc trình tự nucleotide theo nguyên lý Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy. DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào đầu 3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang khơng có nhóm 3'-OH. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide và được phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Vector pJET1.2 được gắn hai trình tự mồi xi và mồi ngược M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai.
Kết quả đọc trình tự được phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại.
2.2.3 Xác định ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của chủng nấm 485 chủng nấm 485
Chủng nấm 485 được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 27-30°C trong 7-10 ngày, sau đó một miếng nấm trên đĩa thạch (1×1 cm) được cấy vào bình nón chứa 100 ml mơi trường PD lỏng và được nuôi lắc 150 vòng/phút ở 27-30°C. Sau 4 ngày, dịch ni có mật độ bào tử 3-5×108/ml được cấy vào các bình nón 250 ml chứa cơ chất theo tỉ lệ 1 ml/10 g cơ chất.
Sau khi lên men 10 ngày ở 27-30°C trong điều kiện tĩnh, bào tử được thu trong dung dịch 0,05% Tween 80 và được đếm dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 640 lần) sử dụng buồng đếm hồng cầu. Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả được xử lí bằng phần mềm Microsoft office excel và phần mềm thống kê SAS.
Ảnh hưởng của nguồn cơ chất: Tám cơ chất khác nhau đã được khảo sát:
gạo, bột gạo, cám gạo, bột ngô, hỗn hợp bột lõi ngô/bột gạo (1:1, w/w), hỗn hợp bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), hỗn hợp bột bã mía/bột gạo (1:1, w/w) và hỗn hợp bột bã mía/bột ngơ (1:1, w/w). Khối lượng cơ chất là 10 g/bình và các loại mơi trường được bổ sung lượng nước lần lượt là 4; 4; 6; 4; 6; 6; 10 và 10 ml/bình.
Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất: Thành phần bột lõi ngô và bột ngô đã được khảo sát ở các tỉ lệ 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7 và 2:8 (w/w). Khối lượng cơ chất là 10 g/bình, nước được bổ sung bằng 60% cơ chất.
Ảnh hưởng của độ dày cơ chất: Sự sinh bào tử của chủng nấm 485 đã được
khảo sát ở các độ dày cơ chất: 9; 11; 13; 15; 17,5; 20; 22,5; 25; 27,5 và 30 mm (tương đương với 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18; 20; 22 và 24 g/bình). Với cơ chất là bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), nước được bổ sung bằng 60% cơ chất.
Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất: Nước được bổ sung vào cơ chất theo các tỉ
lệ 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100 và 110% (so với khối lượng cơ chất) để đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng nấm. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Sự sinh bào tử của chủng nấm 485 đã được khảo
sát ở 25; 28; 30 và 37°C. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 60% cơ chất.
Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ: Ảnh hưởng của năm nguồn nitơ
khác nhau lên sự sinh bào tử của 485 đã được khảo sát: NaNO3; KNO3; NH4NO3; (NH4)2SO4; (NH4)2HPO4. Nguồn nitơ được bổ sung tương đương 0,1 mol N/1000 g cơ chất. Với 10 g cơ chất bột lõi ngơ/bột ngơ (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất.
Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4: Để đánh giá ảnh hưởng của (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau lên sự sinh bào tử của chủng nấm 485, sáu nồng độ (NH4)2SO4 tương đương: 0; 0,02; 0,05; 0,10; 0,20 và 0,50 mol N/1000 g cơ
chất đã được khảo sát. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất.
Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4: Để đánh giá ảnh hưởng của MgSO4 lên
sự sinh bào tử của 485, sáu nồng độ: 0; 0,020; 0,030; 0,035; 0,040 và 0,050% (so với khối lượng cơ chất) đã được khảo sát. Với 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất, bổ sung (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất.
Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4: Sáu nồng độ: 0; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 và 0,30% (so với khối lượng cơ chất) đã được khảo sát để đánh giá ảnh hưởng của KH2PO4 lên sự sinh bào tử của 485. Với 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất, bổ sung (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất.
Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng: Trong thí nghiệm này, chủng 485 được lên men ở các điều kiện đã được tối ưu (30 ± 1°C, thành phần mơi trường trong mỗi bình lên men: 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), nước bằng 70% cơ chất, (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO4 bằng 0,035% cơ chất, KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất). Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh bào tử, chủng nấm được lên men ở ba chế độ chiếu sáng 0 giờ/ngày, 12 giờ/ngày và 24 giờ/ngày.
Ảnh hưởng của thời gian lên men: Trong thí nghiệm này, chủng 485 được
lên men ở các điều kiện đã được tối ưu (30 ± 1°C với chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày, thành phần môi trường trong mỗi bình lên men: 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), nước bằng 70% cơ chất, (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO4 bằng 0,035% cơ chất, KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất). Để tìm thời gian lên men tối ưu cho sản xuất bào tử, chủng 485 đã được lên men và thu bào tử sau 6; 8; 10; 12 và 14 ngày.
3 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao
Mỗi chủng nấm có độc lực khác nhau đối với từng loài rệp và trong từng điều kiện môi trường khác nhau. Dịch bào tử của bảy chủng nấm Lecanicillium spp. được phun lên rệp cải ở 21-25°C và độ ẩm khơng khí 75-80%, số lượng rệp cải sống sót được theo dõi sau bảy ngày phun. Kết quả chỉ có hai chủng 85k và 485 có khả năng diệt được 50% rệp trong thời gian 5 và 4 ngày. Năm chủng còn lại chưa xác định được thời gian để giết chết 50% rệp (hình 3.2).
A B C