(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén)
Thiết bị đƣợc cung cấp với thiết kế nhỏ gọn, dễ sử dụng, chi phí thấp, vừa đƣợc sử dụng để phân tích trong phịng thí nghiệm, vừa có thể đƣợc tối ƣu cho mục tiêu phân tích tại hiện trƣờng.
+ Cân phân tích của hãng Scientech độ chính xác 10-2, 10-4 (gam). + Máy lọc nƣớc deion (Mỹ).
+ Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521.
+ Máy đo pH của hãng HANNA, điện cực thủy tinh, các dung dịch pH chuẩn 4,7,10 để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH.
+ Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu.
2.2.1.2. Dụng cụ:
+ Pipet paster các loại: 20, 100, 200, 1000 µL.
+ Các lọ falcon 15; 25 ml để đựng mẫu và dung dịch chuẩn. + Giấy lọc đƣờng kính màng lọc là 0,45 µm.
+ Mao quản sử dụng là mao quản silica, chiều dài 60 cm, đƣờng kính trong (ID) là 50 µm.
+ Một số dụng cụ thủy tinh thơng thƣờng khác trong phịng thí nghiệm nhƣ: Bình định mức 10 ml, 25 ml, 100 ml pipet bầu các loại 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml, bình tia, que khuấy.
2.2.2. Hố chất:
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA) và đƣợc pha chế b ng nƣớc deion.
2.2.2.1. Chất chuẩn:
Các chất chuẩn đƣợc dùng trong nghiên cứu đều đƣợc mua ở Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng gồm:
+ Cefalexine + Cefotaxim natri + Cefixime trihydrate + Amoxicillin trihydat + Ampicillin trihydat + Cefoperazon + Sulbactam
2.2.2.2. Hóa chất dung mơi:
+ L-Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, Japan, >99%)
+ Tris (hydroxymethyl) aminomethane, (Fluka, Japan, hàm lƣợng >99%) + Ascobic (>99%, Acros Organic (USA))
+ Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức) + Axit clohydric (HCl) (Merck, Đức)
+ Axit axetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)
+ Nƣớc deion: Là nƣớc cất hai lần đƣợc lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết
2.2.2.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất
a) Pha dung dịch chuẩn gốc: Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ 1000 ppm tƣơng ứng với 7 chất phân tích từ chất chuẩn rắn trong nƣớc deion.
Cân chính xác 0,0250 g mỗi loại chất chuẩn, chuyển vào bình định mức 25,0 ml. Thêm khoảng 10 đến 15 ml nƣớc deion và rung siêu âm trong 40 phút, định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C và sử dụng trong 2 tháng. Các dung dịch trƣớc khi sử dụng phải đƣa về nhiệt độ phòng, lắc đều dung dịch trƣớc khi sử dụng.
b) Pha dung dịch đệm điện di:
Hệ đệm dùng trong nghiên cứu là hệ Tris (10mM)/Ace ở khoảng pH 7,5 và 7,8: Cân 0,1211 g Tris trên cân phân tích hịa tan và rung siêu âm đến tan b ng nƣớc deion, chuẩn lại giá trị pH b ng acid acetic trên máy đo pH về pH 7,8 và 7,5 rồi định mức đến vạch b ng nƣớc deion, dung dịch đệm đƣợc pha mới hàng ngày.
2.3. Thông tin mẫu và phƣơng pháp xử lý mẫu thuốc
2.3.1. Thông tin các mẫu thuốc
Thông tin các mẫu thuốc sử dụng để phân tích đƣợc tóm tắt ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2. Thông tin chi tiết các mẫu này đƣợc nêu ở Bảng PL.1 và Bảng PL.2 (phụ lục 1).
Bảng 2.1. Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 1
Stt Tên thuốc Mã thuốc thuốc Dạng Hàm lƣợng ghi trên nhãn 1 Fabafixim 200 D CFX1 Viên nén Mỗi viên chứa 200 mg Cefixim 2 Fabafixim 400 CFX2 Viên nang Mỗi viên chứa 400 mg Cefixim 3 Cefimed 200 CFX3 Viên nén Mỗi viên chứa 200 mg Cefixim 4 Cefalexin 500mg CFL4 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 5 Franlex 500 CFL5 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 6 GOLDCEFO 1G CFT2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 g Cefotaxime 7 Cefalexin 500mg CFL-CH1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 8 BICEBID 100 CFX-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 100 mg Cefixime 9 Cefalexin 500mg CFL-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 10 Cefalexin 500mg CFL-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 11 CEFIXIM 100mg CFX-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 100 mg Cefixime 12 Cefalexin 500mg CFL-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin
Bảng 2.2. Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 2
Stt Tên thuốc Mã thuốc Dạng
thuốc Hàm lƣợng ghi trên nhãn 1 Amoxicillin 500 AM1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 2 Amoxicillin 500 AM2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 3 Amoxicillin AM3 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 4 Ospamox 500 AM4 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 5 Ampicillin 500 AP1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 6 Ampicillin 500 AP2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 7 Amoxicillin 500 AM-CH1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxcillin 8 Amoxicillin 500 AM-CH2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 9 Amoxicillin 500 AM-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 10 Ampicillin 500 AP-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin
11 Amoxicillin 500 AM-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 12 Ampicillin 500 AP-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 13 Amoxicillin 500 AM-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 14 Ampicillin 500 AP-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 15 Auropennz 1.5 APvSB1 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Ampicillin, 0.5 gam Sulbactam, 5 ml nƣớc cất tiêm 16 SUKLOCEF CPvSB Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Cefoparazone,
0.5 gam Sulbactam
17 Sumakin 1.5gam AMvSB1 Dạng gói Mỗi gói chứa 250 mg Amoxicillin, 250 mg Sulbactam
18 MOXYBIOTIC-
S 1.5g AMvSB2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Amoxicillin, 0.5 gam Sulbactam
19 BACTAMOX
625 AMvSB3 Dạng gói Mỗi gói chứa 500 mg Amoxicillin, 125 mg Sulbactam
20 UNASYN 1.5g APvSB2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 g Ampicillin, 0,5 g Sulbactam, 5 ml nƣớc cất tiêm
2.3.2. Phương pháp xử lí mẫu
a) Xử lí mẫu thuốc dạng viên nang
Lấy 10 viên thuốc cân chính xác khối lƣợng (đƣợc khối lƣợng viên thuốc), bỏ phần nang thuốc để lấy phần thuốc bột, trộn đều. Lau sạch phần nang thuốc rồi đem cân khối lƣợng (đƣợc khối lƣợng phần nang thuốc) để tính khối lƣợng trung bình viên. Cân chính xác một lƣợng nhỏ 1/100 khối lƣợng bột đã trộn đều ở trên, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 đến 20 ml nƣớc deion, rung siêu âm khoảng 40 phút rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha lỗng trƣớc khi đƣợc bơm mẫu vào thiết bị CE [3].
b) Xử lí mẫu thuốc dạng viên nén
Lấy 10 viên thuốc dạng nén, cân chính xác khối lƣợng để tính khối lƣợng trung bình viên. Tiến hành nghiền b ng cối mã não đến khi thành dạng bột mịn, trộn đều rồi cân chính xác khoảng 1/100 khối lƣợng bột ở trên, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 đến 20 ml nƣớc deion, rung siêu âm khoảng 40 phút rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha loãng trƣớc khi bơm mẫu vào thiết bị CE.
c) Xử lí mẫu dạng bột tiêm
Cân chính xác khối lƣợng của 1 lọ thuốc, sau đó lấy hết lƣợng thuốc trong lọ ra, trộn đều. Tráng rửa sạch vỏ lọ và sấy tới khối lƣợng không đổi, cân vỏ lọ (đƣợc khối lƣợng vỏ lọ) để tính đƣợc khối lƣợng thuốc trong 1 lọ. Sau khi trộn đều thuốc, cân chính
xác khoảng 1/40 khối lƣợng bột thuốc cho vào bình định mức 25,0 ml rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha lỗng trƣớc khi tiến hành bơm mẫu vào thiết bị CE.
2.4. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích
+ Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với các q trình sắc ký (quá trình điện di) giá trị LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) b ng 3.
+ Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Đối với các quá trình sắc ký (quá trình điện di) giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) b ng 10 [10].
2.4.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp
Độ chụm (độ lặp lại) một cách tƣơng đối là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi và giá trị trung bình trên các mẫu thử giống hệt nhau trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau (cùng ngƣời phân tích, cùng trang thiết bị, phịng thí nghiệm trong các khoảng thời gian ngắn).
Độ chụm (độ lặp lại) có thể xác định qua độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%). Khi độ lệch chuẩn càng lớn thì sai số của phép đo hay của phƣơng pháp càng lớn [10]. Cơng thức tính SD và %RSD là: SD = √∑ %RSD = x100 Trong đó:
+ Si: Diện tích của pic điện di thứ i
+ Stb: Diện tích trung bình của n lần phân tích + n: Số lần phân tích lặp lại
2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp
Độ đúng của phƣơng pháp chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đó, thƣớc đo độ
đúng thƣờng đánh giá qua sai số tƣơng đối hay b ng cách xác định độ thu hồi. Độ thu hồi thƣờng đƣợc xác định b ng phƣơng pháp thêm chuẩn với công thức sau [10]:
Độ thu hồi (H): H = lt tt C C x 100% Trong đó:
+ H: Hiệu suất thu hồi (%)
+ Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu đƣợc (tính theo đƣờng chuẩn) + Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính từ lƣợng chuẩn thêm vào. Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trƣớc khi xử lí mẫu ta có độ đúng của phƣơng pháp, còn nếu chất chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị CE ta có độ đúng của thiết bị. Trong nghiên cứu này, ba mức nồng độ (thấp, trung bình, cao) đƣợc lựa chọn để đánh giá độ thu hồi tƣơng ứng là: Nhóm 1 ở mức nồng độ (60, 80, 100) ppm, nhóm 2 ở mức nồng độ (50, 60, 70) ppm so với nồng độ làm việc của hoạt chất và có mặt nền mẫu (nếu khơng có mẫu tự tạo). Thực hiện nhƣ sau:
1. Từ bột chế phẩm pha 1 dung dịch (dd) khoảng 200 ppm cho mỗi hoạt chất (làm dd nền gốc A).
2. Chuẩn bị một dung dịch chuẩn có nồng độ mỗi hoạt chất 200 ppm (dd B). 3. Chuẩn bị các dung dịch đánh giá độ đúng.
a) Nhóm 1:
+ Mức 60 ppm: Lấy 100 l dd A + 200 l dd B + 700 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 60 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 40 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
+ Mức 80 ppm: Lấy 100 l dd A + 300 l dd B + 600 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 80 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 60 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
+ Mức 100 ppm: Lấy 100 l dd A + 400 l dd B + 500 l nƣớc, lọc đƣợc dung
dịch có nồng độ khoảng 100 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 80 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
b) Nhóm 2:
+ Mức 50 ppm: Lấy 100 l dd A + 150 l dd B + 750 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 50 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 30 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
+ Mức 60 ppm: Lấy 100 l dd A + 200 l dd B + 700 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 60 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 40 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
+ Mức 70 ppm: Lấy 100 l dd A + 250 l dd B + 650 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 70 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 50 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
c) Dung dịch để đánh giá nồng độ A: Lấy 500 l dd A + 500 l nƣớc, lắc đều tiêm điện di (dd C).
Từ kết quả nồng độ dung dịch C và nồng độ các dung dịch thêm chuẩn sẽ tính ra đƣợc độ thu hồi theo hai nhóm ở các nồng độ khác nhau, qua kết quả khảo sát có kết luận về độ đúng (tỷ lệ thu hồi từ 98 – 102%, dao động giữa 3 lần phân tích ở mỗi mức thêm chuẩn RSD không quá 2 %).
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu hảo sát phân tích đồng thời bốn hoạt chất kháng sinh nhóm 1 bằng phƣơng pháp điện di mao quản CE-C4D
3.1.1. Tối ƣu hố các điều kiện phân tích
Khảo sát một số điều kiện phân tích 4 hoạt chất nhóm 1 đƣợc tiến hành trên thiết bị điện di mao quản CE-C4D với cột mao quản có chiều dài 60 cm đƣờng kính trong 50 µm, thế áp vào hai đầu mao quản là +17kV, nồng độ khảo sát của các chất đều là 50 ppm. Các điều kiện khảo sát gồm: Ảnh hƣởng của thành phần và pH của dung dịch đệm điện di, nồng độ đệm, chiều dài hiệu dụng của mao quản, thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu.
3.1.1.1. hảo sát loại đệm và pH của dung dịch đệm điện di
Việc khảo sát đồng thời thành phần và pH của dung dịch đệm điện di với các hoạt chất nghiên cứu ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình di chuyển và phân tách của các chất trong dung dịch.
Trong phƣơng pháp điện di mao quản, khi pH của dung dịch đệm thay đổi sẽ làm thay đổi độ dẫn của dung dịch, từ đó làm thay đổi thời gian di chuyển của các chất phân tích trong mao quản. Do đó, việc chọn các dung dịch đệm điện di cần đảm bảo hai yếu tố là pH phù hợp và detector là detector đo độ dẫn nên dung dịch đệm cần có độ dẫn nhỏ.
Quá trình khảo sát đƣợc tiến hành với ba hệ đệm sau Arg/Ascobic 15 mM; Arg/Ace 15 mM; Tris/Ace 15 mM ở các giá trị pH khác nhau, giá trị pH đƣợc điều chỉnh trên cơ sở thêm dần hợp phần acid (Acetic hoặc Ascobic) vào và giữ nguyên hợp phần bazơ (Tris, Arg) với nồng độ 15 mM cho đến khi đạt giá trị pH muốn khảo sát. Kết quả khảo sát thu đƣợc đƣợc trình bày trong các Hình 3.1; 3.2 và 3.3.
750 700 650 600 550 500 pH=8,0 pH=8,5 pH=9,0 (CFL) (CFT) (SBT) (CFX) 5 mV
Hình 3.1. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Arg/Ascobic ở các pH khác nhau
Từ kết quả khảo sát thu đƣợc cho thấy đệm Arg/Ascobic không thật sự phù hợp để phân tích vì đƣờng nền nhiễu, pic thu đƣợc nhỏ, chân dỗng và khơng cân đối. Ở pH < 8,5 thời gian di chuyển lớn và không thấy xuất hiện pic Cefixime. Do Arg có pKa = 12,488. Vì vậy, để ion hóa các phân tử này cho phân tách b ng CE cần phải sử dụng các dung dịch đệm điện di kiềm mạnh, điều này không khả thi với hệ CE-C4D do yêu cầu độ dẫn điện nền thấp.
Hình 3.2. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Arg/Ace ở các pH khác nhau
Đệm Arg/Ace cho pic ra ổn định, nhƣng chân rất dỗng, tín hiệu pic khơng lớn, thời gian di chuyển lâu. Vì vậy đệm này khơng thật sự phù hợp để lựa chọn.
Hình 3.3. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau
Từ kết quả khảo sát đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau nhận thấy: Ở pH ≤ 7,5 thời gian di chuyển của các pic sẽ lâu hơn, tín hiệu nhiễu và pic thu đƣợc nhỏ, chân pic bị doãng. Ở pH ≥ 8,0 hai pic Cefalexin và Cefotaxime sẽ bị dính và dần bị trùng vào nhau. Do khi pH tăng làm cho dòng EOF tăng, độ linh động điện di của chất phân tích tăng,
550 500 450 400 350 300 250 (CFT) (SBT) (CFX) pH=7,5 pH=8,0 pH=8,5 5mV
Thêi gian di chuyÓn (s) (CFL) 350 300 250 200 150 (CFL) (CFT) (SBT) (CFX) pH=7,0 pH=7,5 pH=7,7 pH=7,8 pH=8,0 5mV
chất phân tích ra nhanh hơn (thời gian di chuyển giảm), khả năng tách chất giảm đi -> làm các pic dễ dính hoặc trùng nhau. Ở pH = 7,7 pic chất của Cefalexin gần EOF hơn nên sẽ rất dễ chịu tác động của dịng này trong suốt q trình phân tích. Ở pH = 7,8 các