CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào
mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro
Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và
sạch bệnh. Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết định thành cơng của tồn bộ q trình. Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống.
Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh
dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa...) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả). Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp.
3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp
Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng... Trong thí nghiệm này hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh. Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra cơng thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 15 ngày thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưở hiệu quả tạo mẫu sạch Cơng thức thí nghiệm Chất khử trùng CT1 Cồn 70⁰ (A) CT2 CT3 CT4 NaClO 2% CT5 CT6 CT7 Cồn 70⁰ (A) + NaClO 2% CT8 CT9 Hình 1. Ảnh hưởng của ch tạo mẫu sạch cây
Qua bảng 3.1 và đồ th 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 CT1 CT2 CT3
ởng của chất khử trùng và thời gian khử
ch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày) trùng Thời gian khử trùng (s) Tỷ lệ mẫu sống (%) (A) 10 47,62 20 28,57 30 14,29 NaClO 2% (B) 300 42,86 600 57,14 900 33,33 (A) + NaClO 2% (B) 10A + 300B 71,43 10A + 600B 90,48 10A + 900B 61,90 a chất khử trùng và thời gian khử trùng đ ch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày)
thị 3.1 ta có nhận xét sau:
CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9
Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
ử trùng đến theo dõi sau 15 ngày)
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 52,38 47,62 38,10 23,81 9,52 19,05 38,01 28,57 33,33 trùng đến hiệu quả theo dõi sau 15 ngày)
Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế bào
thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, thời gian khử trùng với cồn 70⁰ trong 10s (CT1) cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (47,62%) do thời gian
ngắn thành tế bào ít bị phá hủy là nhưng tỷ lệ nhiễm cũng cao (52,38%) do chưa đủ để dung dịch khử trùng giết chết các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 20s (CT2) thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm giảm là 28,57% và 47,62%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 30s (CT3) thì tỷ lệ sống tiếp tục giảm còn 14,29% và 38,1%.
Với chất khử trùng là NaClO 2%
NaClO 2% là hóa chất có tính sát khuẩn cao nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm sẽ giảm nhưng nếu thời gian khử trùng lâu thì dung dịch có thể xâm nhập vào bên trong gây độc với mẫu. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng trong thời gian 5 phút (CT4) thì tỷ lệ nhiếm cao (23,81%) do thời gian chưa đủ để diệt các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút (CT5) thì tỷ lệ nhiễm thấp nhất (9,52%), tỷ lệ sống cao (57,14%). Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên tới 15 phút(CT6) dung dịch đã gây độc cho mẫu nên tỷ lệ sống thấp hơn (33,33%), tỷ lệ nhiễm tăng lên. Như vậy, thời gian khử trùng bằng NaClO 2% tốt nhất là trong 10 phút, cho tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp.
Khử trùng bằng phương pháp kết hợp giữa cồn 70⁰ và NaClO 2%
Khi kết hợp cả hai chất khử trùng trên với thời gian khử trùng thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm của từng chất nên cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ nhiễm giảm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, phương pháp khử trùng là ngâm cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (CT8) cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 90,48% và tỷ lệ nhiễm thấp (28,57%).
Như vậy, thời gian khử trùng mẫu có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Công thức khử trùng CT8 (ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu
tái sinh.
3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro nhân chồi in vitro
Mục tiêu đặt ra của quy trình khử trùng cho bất kỳ loài cây nào đều là tạo được tỷ lệ mẫu sạch cao đồng thời có khả năng tái sinh mạnh. Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng này là bản chất vật liệu làm mẫu cấy. Mẫu cấy tiếp xúc với nước, đất như rễ thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hồn tồn chúng khỏi nguồn mẫu. Mẫu mọng nước, có lơng thường khó khử trùng hơn những mẫu khơng mọng nước, bề mặt nhẵn.
Trong nghiên cứu này các vật liệu được khử trùng được khử trùng theo công thức khử trùng tốt nhất suy ra từ kết quả nghiên cứu phần 3.1.1
3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch
Qua kết quả thí nghiệm 1 cho thấy, điều kiện khử trùng hiệu quả nhất đối với loài Lan Kim tuyến là: Ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. Do đó, để xác định cơ quan vào mẫu phù hợp nhất thí nghiệm tiếp tục áp dụng điều kiện khử trùng trên với các vật liệu khác nhau của cây lan Kim tuyến là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân. Kết quả thu được sau 15 ngày được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng c
Cơ quan vào mẫu
Chồi đỉnh Chồi nách Mắt đốt ngang thân Hình 2. Ảnh hưởng c Theo kết quả ở bảng
đốt ngang thân là vật liệu cho t nhất (16,67%), thứ hai là ch
33,33%, thấp nhất là chồi nách cho t Nguyên nhân của sự khác bi
tuyến (Anoecctochilus setaceus số lượng lớn các mầm bệnh gây nhi khử trùng. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 Chồi đỉnh
ng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạ thu được sau 15 ngày)
Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhi
66,67 33,33
50,00 27,78
t ngang thân 72,22 16,67
ng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch
được sau 15 ngày)
3.2 và hình 2 cho thấy, khi khử trùng mẫ u cho tỷ lệ sống cao nhất (72,2%) và tỷ ai là chồi đỉnh cho tỷ lệ sống là 66,67% và t
i nách cho tỷ lệ sống là 50% và tỷ lệ nhiễ khác biệt này là do đặc điểm thân khí sinh c
setaceus) có rất nhiều lơng tơ do vậy trên b
nh gây nhiễm mẫu, do đó gặp khó khăn trong cơng tác
Chồi nách Mắt đốt ngang thân Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%) ạch (Kết quả nhiễm (%) 3,33 7,78 6,67 ch (Kết quả thu ẫu cấy thì mắt lệ nhiễm thấp ng là 66,67% và tỷ lệ nhiễm là ễm là 27,78%. m thân khí sinh của Lan Kim y trên bề mặt có một p khó khăn trong cơng tác
Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%)
Qua kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này cho thấy, cơ quan vào mẫu thích hợp cho việc tạo mẫu sạch là mắt đốt ngang thân.
3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro
Cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi. Ở một số loài, cơ quan vào mẫu có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao nhất nhưng lại cho hệ số nhân chồi thấp nhất. Do đó, để đạt hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro lồi lan Kim tuyến, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Kết quả thí nghiệm thu được thể hiện qua Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in
vitro (kết quả theo dõi sau 8 tuần).
Cơ quan vào mẫu Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao TB chồi (cm) Chồi đỉnh 33,33 2,11 2,58 Chồi nách 50 3,50 2,97 Mắt đốt ngang thân 100 4,56 3,2 CV% 0 3,6 2,7 LSD0,05 0,01 0,25 0,16
Chồi đỉnh Chồi ngọn Mắt đốt ngang thân
Hình 3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi
Phân tích phương sai một nhân tố với 3 lần lặp của tỷ lệ mẫu sạch, hệ số nhân và chiều cao chồi đều được hiệu của trung bình mỗi cơng thức lớn hơn
nhân và chiều cao TB chồi ở độ tin cậy 95%.
Qua kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi cấy các vật liệu là chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân vào môi trường nhân nhanh phù hợp, kết quả theo dõi sau 8 tuần cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm. Cơ quan nhân kém nhất là chồi đỉnh với tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt 33,33%, hệ số nhân là 2,11 lần và chiều dài chồi là 2,6 cm. Chồi nách cho tỷ lệ tạo mẫu là 44,44%, hệ số nhân 3,5 lần và chiều dài chồi 2,95 cm.
Như vậy, cơ quan vào mẫu thích hợp nhất để tăng hệ số nhân chồi in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là mắt đốt ngang thân.
3.2. Nghiên cứu mơi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp
Trong ni cấy in vitro, mơi trường ni cấy đóng vai trị quan trọng. Vừa
phải cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa phải biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do đó nghiên cứu lựa chọn mơi trường ni cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt.
3.2.1. Xác định mơi trường nền thích hợp cho ni cấy mơ Lan Kim tuyến
(A. setaceus)
Những nghiên cứu về nuôi cấy Phong lan in vitro cho thấy có một số mơi
trường thích hợp để ni cấy Phong lan như: MS; mơi trường Knudson C cho
Cattleya, Cymbidium (Adirti, 1993), môi trường Knudson cải tiến (Knud*), môi
trường Hyponex (Lou and Kako,1995; Nakano et al, 2000...), môi trường Vaccin &Went... Trong đề tài này chúng tơi nghiên cứu ni cấy lồi Lan Kim tuyến trên ba loại môi trường cơ bản: MS, Knudson C và Knud*.
Thể chồi 4 tuần tuổi từ môi trường vào mẫu được cấy vào các môi trường khác nhau là MS, Knud*, Knudson có bổ sung thêm 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả sau:
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến
Môi trường Số chồi (chồi/mẫu) Chiều cao TB chồi (cm) Số lá (lá/chồi) Đặc điểm thể chồi Knud* 3,67 3,57 4,12 Mập, xanh MS 2,11 1,33 1,55 Gầy, xanh nhạt Knudson C 2.06 2,22 2,35 Bé, xanh nhạt CV% 3,1 2,2 2,4 LSD0,05 0,16 0,11 0,12 MS Knud* Knudson C
Hình 4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi
Kết quả phân tích phương sai cho thấy, mơi trường nền có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến.
Theo kết quả ở Bảng 3.4 thấy rằng môi trường Knud* cho số lượng chồi (3,67 chồi/mẫu) và số lá (4,12 lá/chồi) nhiều hơn ở môi trường MS (số lượng chồi 2,11 chồi/mẫu và số lá 1,55 lá/chồi) và Knudson (số lượng chồi 2,06 chồi/mẫu và số lá 2,35 lá/chồi). Đồng thời, trong môi trường Knud* thì chiều dài chồi (3,57cm) dài hơn hẳn so với hai mơi trường cịn lại (MS là 1,33 cm và Knudson là 2,22 cm) và chất lượng chồi cũng tốt hơn chồi mập, xanh.
Như vậy, môi trường nền thích hợp nhất cho nuôi cấy mô lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là ni trường có nguồn gốc Knud*.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hịa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
Chất điều hoà sinh trưởng khơng những là cơng cụ hữu ích giúp chúng ta nghiên cứu sâu hơn về sự phát sinh hình thái thực vật mà còn giúp ta chủ động định hướng cho sự phát triển của thực vật trong ống nghiệm. Đặc biệt với mục đích nhân giống tạo số lượng lớn trong thời gian ngắn thì việc sử dụng các loại chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tái sinh lớn nhất là tất yếu.
3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân số nhân
Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hịa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang Thạch, 2007). Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin...
Trong thí nghiệm này, hai loại cytokinin là BAP và Kinetin được dùng với các nồng độ khác nhau là 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l trên môi trường (Knud* + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar). Kết quả thu được ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)
Cytokinin Nồng độ (mg/l) Số chồi (chồi/mẫu) Số đốt (đốt/chồi) Chiều cao TB
chồi (cm) Đặc điểm chồi
0 (ĐC) 0 1,22 1,54 2,32 Gầy, xanh nhạt
BAP
0,1 2,44 2,16 3,03 Yếu, xanh nhạt
0,5 3,94 2,31 3,16 Khỏe, xanh đậm
1,0 5,22 2,93 3,23 Khỏe, xanh đậm
2,0 4,22 2,37 3,02 Xanh nhạt, có lơng tơ
CV% 2,8 2,4 1,6 LSD0,05 0,17 0,1 0,085 Kinetin 0,1 2,33 1,98 2,45 Yếu, xanh nhạt 0,5 4,22 2,45 3,05 Khỏe, xanh đậm 1,0 4,89 2,68 3,23 Khỏe, xanh đậm 2,0 3,22 2,02 3,08 Xanh nhạt CV% 2,6 2,7 1,6 LSD0,05 0,15 0,1 0,081 0,1 0,5 1,0 2,0 (mg/l)
Ảnh hưởng của BAP
0,1 0,5 1,0 2,0 (mg/l)
Ảnh hưởng của Kinetin
Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi
Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.
Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, mơi trường có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (5,22 chồi/mẫu và 2,93 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các mơi trường có nồng độ BAP khác thì thấp hơn, số lượng chồi khi sử dụng nồng độ 0,1 mg/l BAP là 2,44 chồi/mẫu, ở nồng độ 0,5 mg/l BAP là 3,94 chồi/mẫu, ở nồng độ 2,0 mg/l là 4,22 chồi/mẫu và đối chứng là 1,22 chồi/mẫu, số đốt khi sử dụng các nồng độ 0,1; 0,5; 2,0 mg/l BAP lần lượt là 2,16; 2,33; 2,35 đốt/chồi và đối chứng là 1,54 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng cho chất lượng chồi tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì do nồng độ quá cao và quá thấp nên chồi nhỏ và yếu, xanh nhạt.
Như vậy, việc bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.
Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi
Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các cơng thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và cả chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.