1.5 .Tình hình sử dụng Râu hùm tron gy học cổ truyền Việt Nam
2.4.5. Các phƣơng pháp phân lập các chất
Sắc ký cột là phƣơng pháp thƣờng đƣ c sử dụng để phân tách các chất dựa vào độ phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thƣớc phân tử. Trong nghiên cứu này, việc phân lập các chất đƣ c thực hiện bằng sắc ký cột với chất mang là silica gel (hệ dung môi rửa giải với độ phân cực tăng dần) hoặc Sephadex LH-20 (hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2/MeOH : 1/9 hoặc MeOH).
b. Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)
Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xác định số lƣ ng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần các dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tách ra từ đ . Dựa trên nguyên tắc các chất khác nhau c độ phân cực khác nhau nên đƣ c tách ra ở những vị trí khác nhau. Đây là phƣơng pháp vi lƣ ng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn. Sắc ký lớp mỏng đƣ c thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, dày 0,25 mm, sau đ hiện màu bằng thuốc thử Vanilin/H2SO4 và Ceri sulfat.
c. Kỹ thuật kết tinh
Trong kỹ thuật kết tinh, việc chọn dung mơi thích h p có tầm quan trọng quyết định kết quả của sự kết tinh. Các ƣớc của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung mơi, hịa tan chất bằng 1 loại hoặc 1 hỗn h p dung môi, rồi để kết tinh ở nhiệt độ thích h p (thƣờng ở nhiệt độ lạnh), gạn hoặc lọc tinh thể ra khỏi dịch cái. Tinh thể đƣ c làm khô tự nhiên trong 1-2 giờ, sau đ cho vào ình h t ẩm dƣới áp suất giảm trong 30 ph t, trƣớc khi đem đi xác định điểm chảy hay phân tích quang phổ.
2.4.6 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học
a. Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)
Khối phổ là một trong các phƣơng pháp thƣờng đƣ c sử dụng để xác định khối lƣ ng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, [M+H]+…, từ đ gi p xây dựng công thức phân tử.
Phổ khối lƣ ng đƣ c đo ằng phƣơng pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam.
b. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)
Phổ NMR là phƣơng pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các h p chất hóa học, trong một từ trƣờng. Trong phổ NMR có hai thơng số c đặc trƣng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tƣơng
tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣ c đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với TMS là chất chuẩn nội dựa trên nguyên tắc cộng hƣởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi đƣ c đặt
c. Phổ lưỡng sắc tròn (CD)
PhổCD đƣ c đo trên máy ChirascanTM CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
d. Độ quay cực ([α]D)
Độ quay cực đƣ c đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.5. Phƣơng pháp thống kê
Các kết quả thu đƣ c đƣ c xử lý thống kê sinh học thông qua các phần mềm Excel, Microsoft Word.
Chƣơng 3
Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Râu hùm
Từ các dịch chiết trong Ethanol và nƣớc từ lá cây Râu hùm ch ng tôi đã nghiên cứu xác định các thành phần h p chất thứ sinh chính có trong dịch.
Kết quả Bảng 3.1 cho thấy thành phần các h p chất từ lá Râu hùm thu tại Việt Nam không chứa glycoside, tannins và polysaccharide nhƣng lại có chứa saponin, đƣờng khử, flavonoid và alkaloid.
Bảng 3.1.Kết quả định tính các nhóm chất trong là Râu hùm STT Nhóm chất Phản ứng với thuốc thử Kết quả Kết luận STT Nhóm chất Phản ứng với thuốc thử Kết quả Kết luận
1 Glycoside Phản ứng Legal - Khơng có
Phản ứng Keller-Kiliani +
2 Saponins Hiện tƣ ng tạo bọt + + Có
3 Tannins Pb(CH3COO)2 10% + Khơng có FeCl3 5% - Dung dịch Gelatin 1% - 4 Đƣờng khử Thuốc thử Fehling + Có
5 Polysaccharide Thuốc thử Lugol - Khơng có
6 Axit amin Thuốc thử Ninhydrin 3% + Có
7 Axit hữu cơ Phản ứng với bột Na2CO3 + Có
8 Flavonoid
Phản ứng với dung dịch NaOH +
Có
Hơi NH3 +
Dung dịch FeCl3 5% +
9 Alkaloid Thuốc thử Mayer + Có
Thuốc thử Dragendoff +
Chú thích: + phản ứngdƣơng tính, - phản ứng âm tính, ++ phản ứng mạnh
So với các nghiên cứu trƣớc đây về thành phần của thân và rễ Râu hùm thì các kết quả khơng có sự sai khác [] tuy nhiên về mặt hàm lƣ ng các chất thu đƣ c thì chƣa thể khẳng định. Đặc biệt dịch chiết trong lá râu hùm có thể có chứa nhiều h p chất saponin.
3.2.Điều chế các cặn chiết từ lá cây Râu hùm hoa tíaTacca chantrieri
Tham khảo các tài liệu về các phƣơng pháp tách chiết cho thấy ethnol và methanol có sự tƣơng đồng về độ phân cực tuy nhiên methnol phù h p hơn với những mẫu tƣơi, c hàm lƣ ng saponin cao nên chúng tôi lựa chọn methanol cho việc điều chế các cặn chiết từ lá của Râu hùm.
Từ các mẫu lá T. chantrieriđƣ c phơi khô, nghiền nhỏ thu đƣ c 280g bột khô. Mẫu nguyên liệu dƣới dạng bột khô này (280 g) đƣ c ngâm chiết với 500 mL methanol ở nhiệt độ ph ng trong v ng 24 h sau đ lọc lấy phần dịch chiết. Phần bã nguyên liệu tiếp tục đƣ c ngâm chiết với MeOH thêm 2 lần nữa theo quy trình nhƣ đối với lần chiết thứ nhất.
Quá trình chiết xuất tạo các cặn chiết từ lồi Tacca đƣ c trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1 Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ mẫu lá T. chantrieri
Bột T. chantrieri (280 g)
Ngâm chiếtvới MeOH (3 lần, 24h/lần)
Dịch Metanol
- Cất loại MeOH xuống cịn 1/10V - Pha lỗng bằng nước cất (50 mL)
1.
Dịch MeOH - H2O
Chiết phân bố với hexane
Dịch chiết hexane
Cặn hexane (RH, 1,78 g)
Dịch H2O
Cất loại dung môi
Dịch chiết EtOAc Dịch H2O (RW, 100 mL) Cặn EtOAc
(RE, 3,80 g)
Cất loại dung môi
Dịch chiết MeOH thu đƣ c từ 3 lần chiết đƣ c gom chung và cất loại dung mơi xuống cịn 1/10 thể tích an đầu. Pha lỗng dịch chiết methanol cơ đặc bằng 50 mL nƣớc cất rồi chiết phân bố lần lƣ t bằng các dung môi hexane và ethyl acetate để thu đƣ c dịch chiết hexane, ethyl acetate và dịch nƣớc (RW, 100 mL).
Các dịch chiết hexane và ethyl acetate đƣ c cất loại kiệt dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣ c các cặn chiết tƣơng ứng là cặn hexane (RH, 1,78 g) và cặn ethyl acetate (RE, 3,80 g).
3.2.1. Phân lập chất từ các cặn chiết
3.2.1.1. Cặn hexane (RH, 1,78 g) đƣ c phân tách bằng sắc kí cột trên chất hấp
phụ silica gel, rửa giải bằng phƣơng pháp gradient hệ dung môi hexane:EtOAc gradient (0100% EtOAc) thu đƣ c 4 phân đoạn, kí hiệu RH1-RH4. Do thời gian và điều kiện nên chúng tôi tập trung cho việc phân lập tiếp phân đoạn RH1 và RH2.
Phân đoạn RH1 có chất rắn màu trắng lẫn trong chất dầu màu vàng, rửa phân đoạn này bằng acetone thu đƣ c chất sạch dƣới dạng chất rắn màu trắng, kí hiệu
RHH1 (5,2 mg).
Phân đoạn H2 có chất rắn màu trắng lẫn trong chất màu đen. Rửa phân đoạn H2 bằng MeOH và kết tinh lại trong hốn h p CH2Cl2 : MeOH (9:1) thu đƣ c chất RHH2 (40 mg) dƣới dạng phiến màu trắng.
Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết hexane đƣ c trình bày trong hình 3.2.
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết hexane của loài T. chantrieri
Cặn n-hexane (RH, 1,78 g) RH1 (48 mg) RH2 (236 mg) RH3 (749 mg) RH4 (65 mg)
CC, silica gel, grad. hexane:EtOAc (0→100%) Rửa bằng acetone RHH1 (5,2 mg) - Rửa bằng acetone - Kt. CH2Cl2:MeOH (9:1) RHH2 (40 mg)
3.2.1.2. Cặn chiết ethyl acetate (RE, 3,80 g) đƣ c phân tách bằng sắc kí cột
trên chất hấp phụ Sephadex LH-20, rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:4) thu đƣ c 8 phân đoạn RE1-RE8. Chúng tôi lựa chọn 2 phân đoạn RE2 và RE8 có khối lƣ ng thu đƣ c nhiều nhất cho các nghiên cứu đi sâu về thành phần cho các nghiên cứu tiếp theo.
Phân đoạn RE2 (628 mg) đƣ c rửa bằng MeOH thu đƣ c chất rắn màu trắng, kết tinh lại chất rắn này trong hỗn h p CH2Cl2:MeOH (9:1) thu đƣ c chất rắn màu
dƣới dạng phiến màu trắng, kí hiệu RHE1 (20 mg).
Phân đoạn RE8 (447 mg) đƣ c kết tinh bằng MeOH thu đƣ c chất rắn dƣới dạng bột màu trắng, kí hiệu RHE2 (64 mg). Quá trình phân lập chất từ cặn ethyl
acetate đƣ c trình bày tóm tắt trong hình 3.3 dƣới đây.
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết EtOAc của loài T. chantrieri 3.2.1.3.Cặn chiết từ nƣớc (RW, 100 mL) đƣ c phân tách trên cột Diaion HP- 3.2.1.3.Cặn chiết từ nƣớc (RW, 100 mL) đƣ c phân tách trên cột Diaion HP-
20, rửa cột bằng 100% H2O, MeOH:H2O (25:75, 50:50) và 100% MeOH. Phân đoạn
100% MeOH đƣ c cất loại dung mơi thu đƣ c cặn kí hiệu RWA (1,00 g). Phân đoạn RWA (1,00 g) tiếp tục đƣ c phân tách trên cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng MeOH thu đƣ c 2 phân đoạn RWA1 và RWA2. Phân đoạn RWA2 có khối lƣ ng lớn hơn 830 mg so với 97 mg của phân đoạn RWA1 nên đƣ c chúng tơi tiếp tục phân tích đánh giá
CC, Sephadex LH-20, CH2Cl2:MeOH (1:4) RE1 (93 mg) Cặn EtOAc (RE, 3,80 g) - Rửa bằng acetone - Kt. CH2Cl2:MeOH (9:1) RHE1 (20 mg) RE2 (428 mg) RE3 (86 mg) RE4 (217 mg) RE5 (238 mg) RE6 (423 mg) RE7 (447 mg) Kết tinh MeOH RHE2 (64 mg)
hệ dung môi EtOAc:MeOH (1:0, 9:1) thu đƣ c 6 phân đoạn RWA2.1-RWA2.6. Phân đoạn RWA2.3 đƣ c tinh chế bằng cột sắc kí silica gel pha đảo C-18 với hệ dung mơi H2O : MeOH (1:10:1) thu đƣ c chất RHW1 (3,7 mg). Quá trình phân lập chất từ
pha nƣớc đƣ c trình bày trong hình 3.4.
Hình 3.4 Sơ đồ phân lập các chất từ cặn nƣớc của loài T. chantrieri
RW 100% H2O CC, Diaion HP-20, H2O:MeOH (100:0, 75:25, 50:50, 0:100) Kt. trong acetone/MeOH Dịch nước (RW, 100 mL) RW 75% H2O 50% H2O RW RWA 100% MeOH (1,00g) RWA1 (97 mg) RWA2 (0,83g) CC, Sephadex LH-20, MeOH
CC, Silica gel, EtOAc:MeOH (1:09:1)
RWA2.1 (182 mg) RWA2.5 (141 mg) RWA2.4 (55 mg) RWA2.3 (198mg) RWA2.2 (69 mg) RWA2.3.1 (53 mg) RWA2.3.2 (25 mg) RWA2.3.3 (85 mg)
CC, Silica gel pha đảo C18, H2O:MeOH (1:10:1)
RHW1
3.2.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất
Hợp chất (6S, 9R)-roseoside (RHW1):Chất bột màu trắng, Độ quay cực
[α]30
D+163,9(c 0,09; MeOH); ESI-MS: m/z 385 [M-H]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): Xem bảng 3.1.
Hợp chất Triolein (RHH1): Chất dầu, màu trắng đục.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) H ppm: 5.33 (6H, m, H-9’, H-10’, H-9”, H-10”, H-9”’, H-10”’), 5.24 (1H, m, H-2), 4.27 (dd, J = 4.0, 7.0 Hz, H-1), 4,13 (dd, J = 6.5, 11.5 Hz, H-3), 0.88 (9H, t, J = 7.0 Hz, H-18’, H-18”, H-18’”). 13C NMR (500 MHz, CDCl3) H ppm: 173.17 (C-1’, C-3’), 172.80 (C-2’), 129.95 (C-9’, C-9”, C-9’”), 129.66 (C-10’, C-10”, C-10’”), 68.85 (C-2), 62.06 (C-1, C-3), 34.16 (C-2), 33.96 (C-2, C-2), 31.87 (C-16), 31.85 (C-16, C-16), 24.86 (C-3), 24.80 (C-3, C-3), 27.17 (C-11), 27.12 (C-11, C-11), 22.63 (C-17’, C-17”, C-17’”), 14.03 (C-18’, C-18”, C-18’”).
Hợp chất β-Sitosterol (RHH2=RHE1):Tinh thể dạng phiến, màu trắng. Nhiệt
độ nóng chảy 135-136 oC.1H NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C NMR (125 MHz, CDCl3): xem bảng 3.2.
Hợp chất Daucosterol (RHE2): Chất bột vơ định hình, màu trắng. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6).
3.2.3.Xác định cấu trúc của các chất
Nhƣ vậy, 5 chất đã đƣ c phân lập từ các cặn chiết của loài T. chantrieri bao gồm 2 chất RHH1 và RHH2 từ cặn chiết hexane, RHE1 và RHE2 từ cặn chiết ethyl
acetate; RHW1 từ cặn nƣớc. Bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng chất RHH2 và chất
RHE1 đƣ c xác định là trùng nhau. Cấu trúc của các chất đƣ c xác định bằng các
phƣơng pháp phổ NMR, MS kết h p với tham khảo tài liệu nhƣ sau:
3.2.3.1 Hợp chất (6S, 9R)-roseoside (RHW1)
H p chất RHW1 đƣ c phân lập dƣới dạng chất bột màu trắng, độ quay cực [α]30
D+163,9(c 0,09; MeOH). Phổ khối ESI-MS (negative) cho pic ion phân tử deproton hóa ở m/z 385 [M-H]-. Phổ 1H-NMR của h p chất RHW1 xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH 1,05 (3H, s, CH3-11); 1,06 (3H, s, CH3-12); 1,94 (3H, d, J=1,5 Hz, CH3-13), một nh m methyl dƣới dạng doublet tại H 1,31 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3-10), 3 proton olefin tại δH 5,87 (1H, s), 5,89 (1H, m) và 5,90 (1H, m), 1 proton anome tại δH 4,36 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-1’) và tín hiệu của 9 proton nằm trong khoảng δH 2,16-3,88.
Tín hiệu của nhóm methyl dịch chuyển về phía trƣờng thấp ở 1,94 cho phép dự đoán đây là một methyl liên kết trực tiếp với liên kết đơi. Những tín hiệu này g i ý sự có mặt cấu trúc khung megastigmane chứa 1 đơn vị đƣờng.
Hình 3.5b. Phổ 13C-NMR của hợp chất RHW1
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của RHW1 và hợp chất tham khảo C #,a, bδC a,bδC DEPT a,cδH (mult., J in Hz)
1 42.5 42.4 C - 2 50.7 50.7 CH2 2.17 (d, 17.0) 2.54 (d, 17.0) 3 201.2 201.2 C - 4 127.2 127.2 CH 5.87 (s) 5 167.3 167.3 C - 6 80.0 80.0 C - 7 131.6 131.6 CH 5.89 (m) 8 135.3 135.3 CH 5.90 (m) 9 77.3 77.3 CH 4.44 (m) 10 21.2 21.2 CH3 1.31 (d, 6.5) 11 24.7 24.7 CH3 1,05 (s) 12 23.5 23.4 CH3 1,06 (s) 13 19.6 19.6 CH3 1.94 (d, 1.5) 1′ 102.8 102.8 CH 4.35 (d, 8.0) 2′ 75.3 75.3 CH 3,19 (dd, 8,0; 8,0) 3′ 78.2 78.1 CH 3,24-3,37 (m) 4′ 71.7 71.7 CH 3,24-3,37 (m) 5′ 78.1 78.0 CH 3,24-3,37 (m) 6′ 62.9 62.8 CH2 3.66 (dd, 5.5, 11.5) 3.87 (dd, 2.0, 11.5)
aĐo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz, C#
của chất (6S, 9R)-roseoside [1] Phổ 13C-NMR và DEPT củah p chất RHW1 xuất hiện tín hiệu của 19 cacbon bao gồm 1 cacbonyl ở δC 201.2, 4 nhóm methyl ở δC21.2, 24.7, 23.4 và 19.6, 3 nhóm methin sp2 ở δC 127.2, 131.6 và 135.3, 1 nhóm methin sp3 ở δC77.3, 1 nhóm methylen ở δC50.7, 3 cacbon bậc 4 và 6 cacbon thuộc phân tử đƣờng (5 nhóm oxymethin và 1 nhóm oxymethylen). Cấu hình β của phần đƣờng đƣ c xác định từ hằng số tƣơng
Hình 3.5d. Phổ CD của hợp chất RHW1
Cấu hình tuyệt đối của h p chất đƣ c xác định bằng phân tích phổ CD và so sánh độ chuyển dịch hóa học với các đồng phân lập thể đã iết. Hiệu ứng Cotton tại 240 nm có giá trị dƣơng cho phép xác định cấu hình S cho cacbon C-6 [1]. Từ các dữ liệu phổ NMR, ESI-MS, CD, so sánh độ quy cực với tài liệu tham khảo, h p chất
RHW1 đƣ c xác định là (6S, 9R)-roseoside[1]. H p chất này đƣ c đánh giá c hoạt
tính chống ung thƣ trên d ng tế ào ung thƣ da trên chuột thực nghiệm [2].
3.2.3.2. Hợp chất Triolein (RHH1)
Hình 3.6. Cơng thức cấu tạo chất RHH1
H p chất RHH1 đƣ c phân lập dƣới dạng chất dầu màu trẳng ngà. Phổ 1H- NMR của RHH1 có tín hiệu cộng hƣởng của 2 nhóm oxymethylen tại δH 4.13 (2H, dd,J = 6.0, 11.5 Hz, H-1a và H-3a) và 4.28 (2H, dd,J = 4.0, 7.0 Hz, H-1b và H-3b), một nhóm oxymethine tại δH 5.24 (1H, m, H-2). Các tín hiệu cộng hƣởng này cho biết trong cấu trúc của RHH1 có chứa một phân tử glycerol đã ị este hóa ở cả 3 nhóm hydroxy.
Ngồi các tín hiệu trên ra, phổ 1H NMR cịn có tín hiệu cộng hƣởng của ba nhóm methyl tại δH 0.87 (9H, t, J = 7.0 Hz, H-18, H-18 và H-18), các nhóm methine dạng olefin cộng hƣởng trong vùng δH 5.26-5.39 (6H, m), và tín hiệu cộng hƣởng của các nh m methylene trong vùng trƣờng cao δH 1.20-2.83.
Hình 3.6a. Phổ 1H NMR của RHH1
Phổ 13C NMR và DEPT của RHH1 cho tín hiệu của các nh m car onyl (δC
173.17 và 172.80), các nhóm methin dạng olefin (δC 129.95 và 129.66), một nhóm oxymethin (δC 68.85), hai nh m oxymethylen (δC 62.06), nh m methyl (δC 14.03) và một số nhóm methylen tập trung trong vùng trƣờng cao (δC 22.63-34.16).
Hình 3.6c. Phổ 13C NMR của RHH1
Kết h p các dữ liệu phổ 1H NMR và 13C NMR cho phép dự kiến h p chất
RHH1 là trieste của glycerol với cùng một axit. So sánh số liệu phổ 13C NMR của phần axit trong RHH1 với axit oleic [3]. Sự tƣơng đồng giữa các số liệu cho phép xác định RHH1 là trieste của axit oleic và glycerol có tên gọi là triolein. Cấu trúc của RHH1 là triolein cũng đƣ c khẳng định lại qua việc tham khảo các tài liệu đã công ố
trƣớc đây về triolein và so sánh trên bản mỏng TLC với chất triolein có trong phịng thí nghiệm (Rf = 1,6) [4,5].
3.2.3.3. Hợp chất β-sitosterol (RHH2)