2.2 .2Phƣơng pháp thực hiện
2.2.2.1 Lấy mẫu bệnh phẩm
* Nguyên vật liệu:
Tất cả các mẫu phân của trẻ từ 0 đến 5 tuổi nhập viện do TCC vào các bệnh viện Nhi Khánh Hòa
Các ống nhựa vơ trùng 15ml có nút đậy, nhãn, đá khơ (ice – box)… Phích đá
Thiết bị tủ lạnh âm sâu -200
C để bảo quản mẫu. Phiếu điều tra
* Các bước tiến hành:
Ngƣời nhà bệnh nhi đƣợc hƣớng dẫn lấy mẫu vào ống nhựa vơ trùng, dung tích 15ml có nút đậy, có nhãn ghi đầy đủ thơng tin tên, tuổi, ngày lấy mẫu, số bệnh phẩm.Mẫu đƣợc bảo quản ở -200C sau đó đƣợc vận chuyển tới phịng kiểm nghiệm trong điều kiện đƣợc bảo quản lạnh.
Đối tượng nghiên cứu
Lấy mẫu nghiên cứu
Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Chọn mẫu có chỉ số OD cao
Tách ARN và chạy RT - PCR
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Mỗi bệnh nhi đều có phiểu theo dõi ghi đây đủ các thơng tin: tên, tuổi, giới tính, địa chỉ, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm, các triệu chứng lâm sàng, số lần tiêu chảy trong ngày, kéo dài bao lâu, tính chất phân, độ mất nƣớc, sốt, nôn…
2.2.2.2 Xác định virut Rota trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp ELISA a. Nguyên lý của phương pháp
Hình 7. Sơ đồ mơ tả ngun lý của phƣơng pháp ELISA
Kháng thể gắn trên các giếng sẽ kết hợp với kháng nguyên có trong mẫu bệnh phẩm. Kháng nguyên này sẽ kết hợp với cộng hợp kháng thể gắn enzym tạo thành phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym. Khi có cơ chất của enzym thì cơ chất sẽ bị đổi màu. Nếu trong mẫu bệnh phẩm khơng có kháng nguyên thì phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym không
đƣợc tạo thành, cơ chất không bị đổi màu.
b. Các bước tiến hành
* Chuẩn bị hóa chất và thiết bị
Bộ kit chẩn đoán virut Rota ProSpecT (Anh) gồm các thành phần:
Thành phần Thành phần chính
Phiến chuẩn độ 96 giếng Phủ kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu virut Rota nhóm A
Dung dịch pha lỗng Đệm muối tris
Đối chứng dƣơng virut Rota bò bất hoạt
Cộng hợp Kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu virut Rota gắn với horseradish peroxidase
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Cơ chất TMB Cơ chất chứa chỉ thị màu: 3,3‟ – 5,5‟- tetramethylbenzidine
Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 0,46 mol/lit
Đệm rửa 10X Dung dịch đệm phosphat
Dụng cụ và nguyên vật liệu khác: chai đựng nƣớc, đệm, cồn, đồng hồ, giấy thấm…
Thiết bị: máy đọc đĩa 96 giếng (Microwell plate reader), hãng themrmo Labsystems (Nhật) có thể đọc đƣợc bƣớc sóng 450nm
* Các bước tiến hành:
Pha loãng mẫu 10% (100l mẫu + 900l dung dịch pha loãng)
Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng dƣơng vào giếng đã đánh dấu đối chứng dƣơng
Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng âm vào giếng đã đánh dấu đối chứng âm Nhỏ 2 giọt (100l) các mẫu đã pha loãng vào các giếng đã đánh dấu
Nhỏ 2 giọt (100l) cộng hợp enzym vào tất cả các giếng, vỗ nhẹ trên thành giếng để hỗn hợp trên đƣợc trộn lẫn, đậy nắp và phủ giấy bạc
Ủ ở nhiệt độ Phòng trong 60 ±5 phút
Đổ dịch trong giếng, úp ngƣợc và đập nhẹ phiến lên giấy thấm loại bỏ hết dịch, rửa 5 lần bằng đệm rửa
Nhỏ 2 giọt (100l) dung dịch chứa cơ chất vào từng giếng, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng
Nhỏ 2 giọt (100l) dung dịch dừng phản ứng vào từng giếng, lắc nhẹ phiến Quan sát bằng mắt thƣờng và đọc kết quả ở bƣớc sóng 450nm.
c. Đọc kết quả và kết luận
Đọc kết quả bằng mắt thƣờng: so sánh màu của mẫu với màu của chứng dƣơng và chứng âm.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Th
Dương tính: có màu xanh Âm tính: khơng màu
Hình 8. Kết quả ELISA khi chƣa cho chất dừng phản ứng
Sau khi đã nhỏ dung dịch dừng phản ứng:
Dương tính: có màu vàng
Âm tính: khơng màu
Hình 9. Kết quả ELISA sau khi cho chất dừng phản ứng
Đọc kết quả trên máy ELISA: tại bƣớc sóng 450nm, giá trị hấp phụ hiển thị trên máy tính
Tính kết quả ngƣỡng dƣơng tính:
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Kết luận:
Mẫu dƣơng tính: Khi có đơn vị hấp phụ lớn hơn hoặc bằng X
Mẫu âm tính: Khi có đơn vị hấp phụ nhỏ hơn X
Hình 10. Đọc kết quả mẫu bệnh phẩm trên máy ELISA
2.2.2.3 Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân
a. Nguyên tắc
Mẫu đƣợc ly giải trong điều kiện biến tính cao để bất hoạt RNase và bảo vệ ARN nguyên vẹn. Sau đó sử dụng đệm tạo điều kiện thích hợp để ARN liên kết với màng QIAamp và các mẫu đƣợc gắn vào cột QIAamp mini.
ARN liên kết với màng và các tạp chất đƣợc loại đi bằng cách sử dụng 2 loại đệm rửa khác nhau. ARN tinh sạch sẽ đƣợc hịa tan trong đệm đặc biệt khơng chứa RNase. Các ARN tinh sạch không chứa protein, nuclease, các tạp chất và các chất ức chế khác.
b. Nguyên vật liệu và thiết bị
Kit tách chiết ARN: QIAamp Viral RNA mini Kit, hãng Qiagen, Mỹ Thành phần bộ kit gồm:
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Tên hóa chất Thành phần chính Vai trị
Cột QIAamp mini
- Màng silicagel - Liên kết với ARN mẫu - Bền và không giữ lại Muối Đệm AVL - Guanidine
- Thiocyanate
- Ly giải, phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein, ADN/ARN và biến tính Đệm AW1 Đệm AW2 - Guanidine - hydrocloride - Loại bỏ tạp chất mà không ảnh hƣởng đến liên kết của ARN
Đệm AVE - Natri azid 0,04% - Hòa tan ARN bám trên màng - Tránh nhiễm khuẩn và RNase
- Tăng cƣờng liên kết acid nucleic của virut với màng QIAamp mini
Carier ARN - polyA - Bảo vệ ARN của virut khỏi RNase, tăng độ bền của ARN
Dụng cụ và thiết bị khác:
o Pipet man và đầu côn tƣơng ứng, ống eppendorf, giá để ống
o Máy lắc vontex
o Máy ly tâm
o Bể ổn nhiệt
o Dung dịch Vertrel
c. Quy trình tách chiết
Hút 100l mẫu phân vào 900l PBS tạo dung dịch 10%
Hút 200l dịch mẫu phân 10% vào týp và thêm 200l vertrel/mẫu Vontex trong 1 phút, sau đó ly tâm 3000 vịng/phút trong 10 phút
Hút 140l dịch chiết trên vào 1 týp khác và thêm 560l/mẫu AVL (AVE–ARN carrier)
Lắc, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Thêm 560l/mẫu Ethanol tuyệt đối Lắc, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Tra 630l lên cột QIAamp mini lần 1 vào ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Thêm tiếp 630l lên cột QIAamp mini lần 2 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1
phút. Thay ống thu mẫu bằng ống mới
Cho 500l dung dịch rửa AW1 (có Ethanol) vào cột và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Thay ống thu mẫu bằng ống mới
Cho 500l dung dịch rửa AW2 (có Ethanol) vào cột và ly tâm 14000 vịng/phút trong 3 phút. Thay ống thu mẫu bằng eppendorf 1,7ml mới
Thêm 50l AVE và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút Ly tâm 8000 vòng/phút để thu đƣợc ARN mẫu.
2.2.2.4 Phương pháp xác định týp virut Rota bằng RT – PCR
a. Nguyên lý của phương pháp
Phƣơng pháp nested RT – PCR đƣợc sử dụng để xác định kiểu gen virut Rota lƣu hành, Phản ứng RT – PCR gồm 2 bƣớc:
Trong lần PCR thứ nhất (PCR1), ARN kép của virut Rota tách chiết từ mẫu phân đƣợc dùng làm khn cho q trình phiên mã ngƣợc, đồng thời xảy ra phản ứng khuếch đại nhờ sử dụng enzym Taq polymerase. Sản phẩm của PCR1 đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp các đoạn ADN đặc trƣng cho từng kiểu gen G và P.
Phản ứng PCR2 sử dụng hỗn hợp các mồi (primer) đặc hiệu cho các týp, các mồi nằm ở các vùng biến đổi của gen nhƣng mỗi týp huyết thanh vùng này lại không thay đổi. Sản phẩm của PCR2 thu đƣợc sẽ tiến hành chạy điện di giúp xác định kiểu gen của virut Rota.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Bảng 6. Các primer đƣợc sử dụng để định týp G và týp P
Giai
đoạn Tên primer Trình tự (5’ – 3’)
Vị trí trên đoạn gen Primer đặc hiệu cho kiểu gen G PCR1
VP7 - E ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC 51-71
VP7 – R AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC 914-932
PCR2
VP7 - R AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC 914-932
aBT1 (G1) CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 314-335 aCT2 (G2) CAA TGA TAT TAA CAC ATT TTC TGT
G 411-435
mG3 (G3) ACG AAC TCA ACA CGA GAG G 250-269
aDT4 (G4) CGT TTC TGG TGA GGA GTT G 480-498
aDT8 (G8) GTC ACA CCA TTT GTA AAT TCG 178-198
mG9 (G9) CTT GAT GTG ACT AYA AAT AC 757-776
mG10 (G10) ATG TCA GAC TAC ARA TAC TGG 666-687
Primer đặc hiệu cho kiểu gen P PCR1
VP4 – F TAT GCT CCA GTN AAT TGG 132-149
VP4 - R ATT GCA TTT CTT TCC ATA ATG 775-795
PCR2
VP4 - F TAT GCT CCA GTN AAT TGG 132-149
2T–1 (P[4]) CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC 474-494 3T–1(P[6]) TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA 259-278
1T–1D (P[8]) TCT ACT GGT TTR CAN TGC 339-356
4T–1 (P[9]) TGA GAC ATG CAA TTG GAC 385-402
5T–1 (P[10]) ATC ATA GTT AGT AGT CGG 575-594
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Vị trí của các primer trong phản ứng PCR và sự hình các đoạn gen khác nhau của gen G và P đƣợc thể hiện ở hình sau:
Hình 11. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen G
Hình 12. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen P
Bản phiên mã đầu tiên Gen P[6] Gen P[11] Gen P[8] Gen P[9] Gen P[4] Gen P[10]
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
b. Nguyên vật liệu và thiết bị
* Thiết bị:
Máy PCR Model: Gene Amp PCR System 9700, Applied Biosystems, Mỹ
Máy trộn IKA, Anh
Máy ly tâm Hettich, Đức Máy làm đá Fiocchetti, Mỹ
* Nguyên vật liệu chung:
PCR đệm 10X 25mM MgCl2 RT
Taq ADN polymerase 100mM dNTPs Nusieve GTG agarose Seaplaque agarose TBE 10X Loading dye 6X GeneRuller 100 bp ADN
Khay đựng, pipet aid, đầu côn, eppendorf…
c. Các bước tiến hành
* Các bước tiến hành chạy RT – PCR định týp G
Chuẩn bị Master Mix cho PCR1:
Thành phần Thể tích (l)/mẫu RNA 5 Đệm 10X (chứa Mg2+ ) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP7E (100 ng) 1 VP7R (100 ng) 1
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
H2O (DEPC, deionized) 70,7
Tổng 98,7
Thực hiện PCR1:
o Tính số mẫu cần xác định týp G, lấy đủ ống và ghi tên mẫu hay kí hiệu
o Lấy 5l ARN đã tách chiết của từng mẫu cho vào mỗi ống
o Bổ sung Master Mix vào các ống phản ứng với tổng thể tích là 98,7l
o Đặt các ống vào máy PCR và biến tính ở 970C/5 phút
o Lấy mẫu ra nhanh và đặt trong đá 3 phút
o Cho tiếp 1 l RT/ mẫu và 0,3 l Taq/ mẫu
o Đặt mẫu vào máy PCR và cài đặt chạy chƣơng trình nhiệt để tổng hợp cDNA ở 420C/60 phút, tiếp tục chạy PCR1 với chƣơng trình 940C/1 phút, 420C/2 phút; 680C/1 phút trong 30 chu kỳ
o Kết thúc chƣơng trình lấy mẫu ra vào bảo quản ở 40 C. Chuẩn bị Master Mix cho PCR2:
Thành phần Thành phần (l)/mẫu cDNA 1 Đệm 10X (Chứa Mg2+ ) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP7E (100 ng) 1 Gmix (100 ng) 4
H2O (DEPC, deionized) 72.7
Taq 0.3
Tổng số 100
Thực hiện PCR2:
o Lấy đủ số ống và ghi rõ kí hiệu
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
o Chạy PCR theo chƣơng trình: 940C/1 phút; 420C /2 phút; 680C /1 phút trong 30 chu kỳ
o Kết thúc chƣơng trình lấy mẫu ra vào bảo quản ở 40C để chuẩn bị điện di.
* Các bước tiến hành chạy RT – PCR định týp P
Chuẩn bị Master Mix cho PCR1:
Thành phần Thể tích(l)/mẫu RNA 5 Đệm 10X (Chứa Mg2+ ) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP4F (100 ng) 1 VP4R (100 ng) 1
H2O (DEPC, deionized) 70.7
Tổng 98.7
Chuẩn bị Master Mix cho PCR2:
Thành phần Thể tích(l)/mẫu cDNA 5 Đệm 10X (Chứa Mg2+ ) 10 dNTPs (5 mM) 4 VP4F (100 ng) 1 Pmix (100 ng) 6 H2O (DEPC, deionized) 73.7 Taq 0.3 Tổng 100
Thực hiện các bƣớc tƣơng tự xác định kiểu gen G với chƣơng trình chạy PCR cài đặt nhƣ sau:
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
o Chƣơng trình nhiệt để tổng hợp cDNA ở 420C/60 phút, tiếp tục chạy PCR1 với chƣơng trình: 940
C/1 phút; 500
C /2 phút; 720C/1 phút trong 30 chu kỳ.
o Chƣơng trình PCR2: 940C/1 phút; 500C/2 phút; 720C/1 phút trong 40 chu kỳ.
2.2.2.5 Chạy điện di và đọc kết quả
a. Nguyên lý
Chiều dòng điện chạy từ cực dƣơng sang cực âm.
b. Nguyên vật liệu và thiết bị
Thạch Agarose 2%
Dung dịch ethidium bromide (0,5mg/ml) Dung dịch đệm chạy điện di TBE 1X Thang chuẩn 100 Bp Ruller
Thuốc nhuộm Gel loading Dye 6X Giấy parafin
Bộ điện di gồm: khay đổ thạch và lƣợc, bể điện di, nguồn cung cấp dòng điện 1 chiều
Máy chụp ảnh gel có đèn tím nối với máy vi tính.
c. Các bước tiến hành
Pha thạch Agarose 2% trong đệm TBE 1X
Đổ thạch, mỗi bản gel cần khoảng 70 – 80 ml, đặt bản gel vào bể điện di sao cho ngập bản gel.
Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu lên bản gel
Hút 5 ml sản phẩm PCR2 trộn đều với 3 ml loading Dye 6X trên giấy parafin và nạp toàn bộ hỗn dịch này lên các giếng trên bản gel. Sắp xếp các mẫu theo sơ đồ và ghi lại (trong đó 01 giếng chính giữa nạp thang chuẩn) Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 150V, 60 mA khi mẫu chạy đƣợc
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Nhuộm bản gel sau điện di trong Dung dịch ethidium bromide 0,5mg/ml trong 30 – 45 phút
Soi gel dƣới đèn tím, chụp ảnh và đọc kết quả.
Hình 13. Ảnh minh họa vị trí mẫu trên bản gel
d. Đọc kết quả và kết luận
So sánh với thang chuẩn để xác định kích thƣớc các ADN thu đƣợc sau PCR2:
Bảng 7. Bảng tra kích thƣớc các kiểu gen G, P sau khi điện di
Kích thƣớc ADN kiểu gen G Kích thƣớc ADN kiểu gen P
179bp G9 146bp P[6] 266bp G10 191bp P[11] 452bp G4 224bp P[8] 521bp G2 270bp P[9] 618bp G1 362bp P[4] 682bp G3 462bp P[10] 754bp G8 Kết luận:
o Các mẫu hiện “băng” sẽ có vị trí tƣơng ứng với kích thƣớc bao nhiêu trên thang chuẩn 100 Bp Ruller
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
o Các mẫu hiện nhiều hơn 1 “băng”, vị trí các băng tƣơng ứng với kích thƣớc của kiểu gen nào đó trên thang chuẩn thì đó là kiểu nhiễm hỗn hợp.
Hình 14. Ảnh minh họa kiểu gen G phân tích trên gel agarose 2%
*Chú thích: Ma – Thang chuẩn
Hình 15. Ảnh minh họa kiểu gen P phân tích trên gel agarose 2%
2.2.2.6 Phương pháp thống kê xử lý số liệu
Sử dụng chƣơng trình giám sát dịch tễ học virut Rota “VIRUT ROTA SENTINEL” để tổng hợp và phân tích số liệu.
Các số liệu nghiên cứu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp so sánh khi bình phƣơng (2) để đánh giá kết quả thu đƣợc, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi P < 0,05. 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp 500 bp 200 bp 300 bp 400 bp 100 bp 500 bp
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ TCC DO VIRUT ROTA TẠI BỆNH VIỆN NHI KHÁNH HÕA NĂM 2010 KHÁNH HÕA NĂM 2010