CHƢƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo
2.2.1.1. Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1
Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS Công thức gram/ lít Cơng thức gram/ lít Peptone 10 Cao thịt 10 Cao nấm men 5 Glucose 20 Tween 1giọt
Dipotassium hydrogen phosphate 2
CH3COONa 5
Triammonium citrate 2
MgSO4 0,1
MnSO4 0,05
+ Pha mơi trƣờng MRS với thành phần hóa chất nhƣ bảng 1, chỉnh pH=6, bổ sung 1 lít nƣớc cất. Sau đó, mơi trƣờng đƣợc hịa tan bằng thiết bị khuấy từ (IKA, Đức), và đem đi khử trùng bằng nồi hấp (ALP, Nhật) ở 121ºC trong vòng 15 phút.
+ Chủng KC1 đƣợc bảo quản ở 4o - 6oC đƣợc cấy trên đĩa petri chứa mơi trƣờng MRS có bổ sung agar theo phƣơng pháp cấy ria, sau đó ủ ở 37oC trong 24 giờ. + Khuẩn lạc phát triển đƣợc nhân giống cấp II với mơi trƣờng MRS lỏng trong bình tam giác 50 ml.
2.2.1.2. Kiểm tra khả năng sinh GABA của chủng KC1
Chủng KC1 sẽ đƣợc cấy vào môi trƣờng MRS có bổ sung 5% MSG và lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ. Dịch ni cấy sau khi ly tâm 1500 vịng trong 15 phút sẽ đƣợc phân tích bằng TLC để đánh giá khả năng sinh GABA.
2.2.1.3. Đánh giá chất lƣợng cám gạo
Các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lƣợng protein, lipid, tro tổng số, chất xơ tổng số, mảnh vật sắc nhọn đƣợc kiểm nghiệm.
Phương pháp xác định độ ẩm
Việc xác định độ ẩm của cám gạo đƣợc tiến hành theo TCVN-4326-86.
+ Sấy khô chén ở nhiệt độ 100ºC, để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lƣợng chén. + Lấy 100 g cám gạo cho vào chén cân đã sấy khô, cân trọng lƣợng chén với mẫu (S1) trƣớc khi cho vào sấy.
+ Cho chén với mẫu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100-105ºC trong khoảng 6-8 giờ để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phịng, cân đến trọng lƣợng mẫu khơng đổi (S2). + Tính độ ẩm: S1 - S2 (g).
Phương pháp xác định hàm lượng protein
Việc phân tích xác định hàm lƣợng nitơ trong cám gạo đƣợc áp dụng theo phƣơng pháp Kjeldahl cho phép xác định hàm lƣợng protein thô.
Phương pháp xác định hàm lượng lipid
+ Sấy cốc nhôm ở nhiệt độ 100-105°C trong thời gian 2-3 giờ. Gắp cốc vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng và cân trọng lƣợng cốc (B).
+ Cân 100 g mẫu cho vào ống cân mẫu (ống bằng giấy để chiết suất mỡ), đặt lên trên mẫu một lớp bông đã khử mỡ và lắp vào ống mẫu. Lắp toàn bộ ống mẫu vào bộ chƣng cất mẫu.
+ Đổ khoảng 70 ml ete-petrol có nhiệt độ sơi 40-600°C vào cốc chƣng cất và lắp cốc vào bộ chƣng cất mẫu.
+ Chƣng cất mẫu trong thời gian 45-60 phút.
+ Sau đó lấy cốc chƣng cất ra và sấy ở nhiệt độ 100-105°C trong thời gian 30 phút. + Gắp cốc chƣng cất có mỡ vào bình hút ẩm để nguội và cân trọng lƣợng cốc và mỡ thu đƣợc (A).
+ Tính kết quả: A - B (g).
Trong đó: A - Trọng lƣợng cốc và mỡ (g). B - Trọng lƣợng cốc chƣng cất (g).
Phương pháp xác định tro tổng số
Tro hoá mẫu bằng nhiệt: + Chuẩn bị mẫu.
+ Rửa sạch cốc nung bằng nƣớc, sấy trong tủ sấy ở 105°C trong 30 phút nung trong lò nung ở 525°C. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác đến 0,001 g. Quá trình nung đƣợc lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lƣợng khơng đổi.
+ Cân 100 g cám với độ chính xác 0,001 g trong cốc nung đã chuẩn bị. + Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lƣợng khối lƣợng không đổi. + Nung ở nhiệt độ 525°C cho đến khi thu đƣợc tro màu trắng ngà.
+ Làm nguội trong bình hút ẩm.
+ Quá trình nung đƣợc lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lƣợng khơng đổi. + Tính kết quả: X = m2 - m1 (g).
X: Hàm lƣợng chất tro. m1: Khối lƣợng cốc nung (g). m2: Khối lƣợng cốc nung và tro (g).
Phương pháp xác định hàm lượng các chất xơ
+ Xơ thơ là phần cịn lại sau khi xử lý mẫu với dung dịch H2SO4 1,25% và NaOH 1,25% .
+ Chuẩn bị mẫu: Các mẫu cám gạo đƣợc sấy khơ. + Axit hóa:
- Trộn 100 g mẫu cám gạo với ê-te.
- Sau đó chuyển vào bình cầu dung tích 600 ml.
- Cho 2 g xơ ceramic vào 200 ml H2SO4 1,25% đã đun sôi và 1 giọt an-ti-foam A. - Đặt bình cầu vào nồi chƣng cất có điều chỉnh nhiệt độ và đun sôi 30 phút.
- Lấy bình cầu ra và lọc dung dịch qua phễu.
- Tráng bình bằng 50-75 ml nuớc nóng và rửa sạch phễu. - Rửa lại bình cầu 3 lần với 50 ml nuớc và làm khơ bình.
- Chuyển toàn bộ cặn trong phễu sang bình cầu trở lại bằng cách bịt ngón tay đầu dƣới phễu và quay ngƣợc để cặn rơi vào bình.
+ Kiềm hóa:
- Thêm 200 ml NaOH 1,25% đã đun sơi vào bình cầu và đun sôi trong 30 phút. - Lấy bình ra và lọc nhƣ trên. Rửa sạch với 25 ml H2SO4 1,25% đã đun nóng, 3 lần nuớc sơi 50 ml và 25 ml cồn.
- Chuyển tồn bộ cặn sang cốc đốt khống. + Khống hóa:
- Sấy khô 2 giờ ở 130ºC, làm nguội ở bình hút ẩm và cân.
- Khống hóa ở 600ºC trong 30 - 60 phút, đến khi mẫu trắng đều hoàn toàn. - Làm nguội ở bình hút ẩm và cân lại.
Trong đó: Wd: khối lƣợng mẫu sau sấy (g). Wi: khối lƣợng sau khống hóa (g).
2.2.1.4. Xác định hoạt tính của glutamate decacboxylase trong cám gạo
+ 10 g cám gạo đƣợc đun ở 40ºC trong đệm 2-morpholinoethanesulfonic (MES) 0,1 M cùng với 20 μM PLP. Thể tích của phản ứng là 3 ml.
+ Phản ứng đƣợc thêm một dãy nồng độ MSG 5;10;20;40;80;100;200 mM hòa tan trong 0,1 M MES, pH=5,5 ủ trong 20 phút và lắc đều.
+ Kết thúc phản ứng xảy ra bằng thêm 1 ml axít trichloroacetic 8%. + Sau đó tính hàm lƣợng Glutamic acid tạo thành.
+ Hoạt tính của enzym này sẽ đƣợc tính tốn từ đƣờng cong giữa mối quan hệ của Glutamic acid đƣợc sản xuất và thời gian ủ với PLP.
2.2.1.5. Xác định glutamic axit bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
+ Pha dung môi làm sắc ký gồm: butanol: acetic acid: nƣớc cất theo tỉ lệ 5:3:2 và 0,04% ninhydrin.
+ Chấm 2 μl dịch sau khi đã qua lọc ở trên lên bản sắc ký. Sau đó để khơ và nhúng vào dung mơi chạy sắc ký.
+ Sau khi chạy đƣợc khoảng 10 cm tính từ điểm ban đầu thì làm khơ bản sắc ký. + Lƣợng glutamic acid trong các mẫu sẽ đƣợc so sánh với glutamic chuẩn.
2.2.1.6. Định lƣợng glutamic acid bằng phƣơng pháp so màu
Xây dựng đường chuẩn glutamic acid
+ Pha loãng glutamic acid chuẩn ở các nồng độ 0, 1, 2, 4, 8, 16 mM. + Lấy 0,2 ml dịch lỏng trên bổ sung thêm 1 ml đệm.
Thành phần đệm gồm: - 1 ml dung dịch ninhydrin 1% - 2,4 ml dung dịch glycerol 5% v/v - 0,2 ml citrate 0,5 M
- 100 mg/ml MnCl2 + Sau đó hỗn hợp này đƣợc lắc và đun sơi trong 12 phút.
+ Làm lạnh bằng nƣớc. Sau đó đo quang phổ ở bƣớc sóng 570 nm.
Xác định nồng độ glutamic acid trong dịch mẫu
+ Dịch cám gạo sau khi đƣợc chiết đƣợc bổ sung đệm nhƣ phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn glutamic acid.
+ Lấy 0,2 ml dịch lỏng trên bổ sung thêm 1ml đệm.
Thành phần đệm gồm: - 1 ml dung dịch ninhydrin 1% - 2,4 ml dung dịch glycerol 5% v/v - 0,2 ml citrate 0,5 M
- 100 mg/ml MnCl2 + Sau đó, hỗn hợp này đƣợc lắc và đun sôi trong 12 phút.
+ Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng tuyến tính của glutamic acid chuẩn sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của glutamic acid.
2.2.1.7. Chiết xuất glutamic acid trong cám gạo bằng phƣơng pháp nƣớc sôi
+ 100 g cám gạo đã loại bỏ phần dầu đƣợc ngâm trong 500 ml nƣớc cất (tỉ lệ 20%). + Hỗn hợp sau đó đƣợc đem xử lý với nhiệt độ 80ºC, 90ºC, 100ºC, 110ºC, 120ºC, 130ºC, 140ºC trong thời gian 30 phút bằng nồi khử trùng (ALP, Nhật).
+ Làm lạnh trong bể đựng đá 15 phút.
+ Sau đó hỗn hợp này đƣợc lọc qua giấy lọc Whatman. Phần dịch lỏng thu đƣợc đem
đi phân tích hàm lƣợng glutamic acid.
2.2.1.8. Xác định GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [41]
Dịch lên men bằng vi sinh vật trên môi trƣờng cám gạo có bổ sung 5% MSG đƣợc ly tâm và phân tích định tính GABA theo phƣơng pháp sắc ký bản mỏng và so màu.
+ Dịch lên men sau khi ly tâm 1500 vịng trong 15 phút sẽ đƣợc phân tích bằng sắc ký bản mỏng (TLC).
+ Lấy 0,5 μl dịch chấm lên bản mỏng sắc ký để khô và nhúng vào dung dịch đệm gồm: butanol: axit axetic: nƣớc cất theo tỉ lệ: 5:3:2 và 0,04% ninhydrin trong 4 giờ. + Làm khô bằng sấy để hiện băng.
2.2.1.9. Định lƣợng GABA bằng phƣơng pháp so màu [57]
Xây dựng đường chuẩn GABA
+ Pha loãng GABA chuẩn ở các nồng độ 0, 1, 2, 4, 8, 16 mM. + Bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nƣớc trong 10 phút. + Làm khô bằng thiết bị cô quay.
+ Thêm 1 ml LaCl3 nồng độ 70 mM. + Mẫu đƣợc lắc trong 15 phút.
+ Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Lấy 800 µl dịch lỏng sau khi ly tâm chuyển sang ống eppendorf mới. + Thêm 160 μl KOH 1 M vào dịch mới thu đƣợc, lắc đều trong 5 phút. + Tiếp tục ly tâm trong 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Lấy 550 μl dịch ly tâm + 200 μl đệm đệm K+pyrophosphat 0,5 M (pH 8,6) + 150 µl NADP 4 mM + 50 µl GABASE/ml + 50 µl α-ketoglutarate 20 mM. + Hỗn hợp dung dịch này đƣợc đọc trên máy đo quang phổ.
+ Bƣớc sóng ban đầu đọc ở 340 nm trƣớc khi bổ sung α-ketoglutarate.
+ Sau khi bổ sung α-ketoglutarate trong 60 phút. Đo lần hai với bƣớc sóng 340 nm.
Xác định nồng độ GABA trong dịch mẫu
+ Dịch lên men sau khi đã đƣợc ly tâm, bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nƣớc trong 10 phút.
+ Bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nƣớc trong 10 phút. + Sau đó đƣợc làm khơ bằng thiết bị cơ quay.
+ Thêm 1ml LaCl3 nồng độ 70 mM. + Mẫu đƣợc lắc trong 15 phút.
+ Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vịng/phút trong 5 phút. + Lấy 800 μl dịch lỏng sau khi ly tâm sang ống eppendorf mới.
+ Thêm 160 μl KOH 1 M vào dịch mới thu đƣợc, lắc đều trong 5 phút. + Tiếp tục ly tâm trong 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Lấy 550 μl dịch ly tâm + 200 μl đệm đệm K+pyrophosphat 0,5 M (pH 8,6) + 150 µl NADP 4 mM + 50 µl GABASE/ml + 50 µl α-ketoglutarate 20 mM. + Hỗn hợp dung dịch này đƣợc đọc trên máy đo quang phổ.
+ Bƣớc sóng ban đầu đọc ở 340 nm trƣớc khi bổ sung α-ketoglutarate.
+ Sau khi bổ sung α-ketoglutarate trong 60 phút. Đo lần hai với bƣớc sóng 340 nm. + Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng GABA chuẩn sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của GABA.
2.2.1.10. Xác định nguồn vơ cơ và hữu cơ thích hợp lên men
Nguồn NaCl
+ 1 lít dịch chiết cám gạo đƣợc bổ sung thêm 5% MSG.
+ Bổ sung thêm NaCl với tỉ lệ lần lƣợt là 0, 1, 3, 5, 7% vào mơi trƣờng dịch chiết cám gạo.
+ Sau đó khử trùng và điều chỉnh pH=6,5. + Đƣa thêm 1% dịch chủng gốc.
+ Thời gian lên men kéo dài 96 giờ, ở 34ºC, lắc với tốc độ 150 vòng/phút. + Định lƣợng GABA tạo thành trong dịch lên men.
Nguồn Cacbon
+ 1 lít dịch chiết từ cám gạo đƣợc bổ sung thêm 5% MSG.
+ Sau đó lần lƣợt bổ sung thêm 1%, 2% glucose, lactose, galactose, frutose, maltose. + Khử trùng và điều chỉnh pH=6,5.
+ Thời gian lên men kéo dài 96 giờ, ở 34ºC, lắc với tốc độ 150 vịng/phút. + Sau đó các mẫu đƣợc xác định hàm lƣợng GABA.
Nguồn Nitơ
+ 1 lít dịch chiết từ cám gạo đƣợc bổ sung thêm 5% MSG. + Lần lƣợt bổ sung 0,5%, 1%, 2%, 4%, 8%, 16% cao nấm men. + Các mẫu đƣợc khử trùng và điều chỉnh pH=6,5.
+ Đƣa thêm 1% dịch chủng gốc.
+ Thời gian lên men kéo dài 96 giờ, lắc với tốc độ 150 vịng/phút. + Sau đó các mẫu đƣợc xác định hàm lƣợng GABA.
Tỉ lệ bổ sung MSG thích hợp cho lên men
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 3%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15% MSG. Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT lên men ở điều kiện tối ƣu theo các thơng số chỉ ra ở trên.
2.2.1.11. Tìm các điều kiện lên men thích hợp trên mơi trƣờng dịch cám gạo
pH thích hợp cho lên men
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo sẽ đƣợc bổ sung 5% MSG ở các giá trị pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8. Sau đó cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT để ở nhiệt độ 30ºC, 96 giờ cùng với tỉ lệ oxy 40% để đánh giá hiệu quả pH trong quá trình sản xuất GABA.
Nhiệt độ thích hợp cho lên men
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo sẽ đƣợc bổ sung 5% MSG, pH=6. Sau đó cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT ở các nhiệt độ 18ºC, 22ºC, 26ºC,
30ºC, 34ºC, 38ºC, 42ºC, lên men trong 96 giờ cùng với tỉ lệ ơxy 40% để đánh gía ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên bằng dịch cám gạo.
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 5% MSG, pH=6. Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT giữ ở 30ºC trong các khoảng thời gian khác nhau: 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, và tỉ lệ ôxy 40% .
Tỉ lệ ơxy thích hợp cho lên men
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 5% MSG, pH=6. Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT giữ ở 30ºC trong 96 h, và tỉ lệ ôxy 0%, 10%, 20%, 40%, 60%.
2.2.2. Tinh chế GABA [31] 2.2.2.1. Khử màu
+ Lấy dịch lên men sau khi đã đƣợc ly tâm bổ sung thêm than hoạt tính. + Khuấy đều sau đó giữ ở 80°C trong 20 phút.
+ Tiếp tục khuấy trong 10 phút. + Lọc thu dịch.
+ Dịch này cho vào đơng khơ và hịa lại với nƣớc cất.
2.2.2.2. Khử muối
+ Dịch này sẽ đƣợc bổ sung thêm cồn tuyệt đối.
+ Giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 h.
+ Lọc thu dịch và loại bỏ lƣợng cồn bằng thiết bị cô chân không. + Dịch còn lại đƣợc bổ sung thêm nƣớc cất.
2.2.2.3. Chạy sắc ký trao đổi ion
Chuẩn bị cột
+ Chuẩn bị nhựa sulfonate-polystyrene có bản chất là nhựa trao đổi cation mạnh của hãng Sigma (IR-120 Plus) ngâm trong nƣớc cất trong 12 h.
+ Sau đó đƣa nhựa trao đổi ion này lên cột.
+ Tiếp tục cân bằng cột bằng HCl 1 N với tốc độ dòng chảy là 0,9 l/h. + Rửa lại cột bằng nƣớc cất.
Đƣa mẫu lên cột
+ Mẫu đƣợc đƣa với tốc độ 0,6 l/h.
+ Tiếp tục rửa trôi bằng nƣớc cất với tốc độ là 1,2 l/h.
+ Tiếp tục rửa trôi bằng đệm NH3 nồng độ là 0,1 M với tốc độ 1,2 l/h.
Thôi cột
+ Thôi cột bằng NH3 nồng độ 1 M với tốc độ là 0,6 l/h. + Dịch thôi ra đƣợc thu với các phân đoạn có thể tích là 5 ml. + Phân tích định tính GABA ở mỗi phân đoạn thu đƣợc. + Các phân đoạn có GABA tiếp tục đƣợc kết tinh.