Khảo sát hệ dung môi rửa giải và pha rắn hấp phụ
Nhồi pha hấp phụ rắn (Silicagel 0,063-0,2mm, Florisil 100-200 U.S.mesh) vào cột xilanh cỡ 1 (d = 5mm) từng lƣợng nhỏ, lắc đều, thông số thiết kế cột đƣợc trình bày ở Bảng 2.1:
Bảng 2.1: Thơng số thiết kế cột nhồi
Pha hấp phụ Khối lƣợng (g) Chiều cao cột nhồi (cm)
Silicagel 0,5 5
Florisil 0,6 5
Pha mẫu vào methanol nồng đô ̣ khoảng 0,01 g/ml rồi đƣa lên cô ̣t 0,2 ml dung dịch này. Đƣa cột lên hê ̣ thống chiết pha rắn và thƣ̉ nghiê ̣m sơ bô ̣ để khảo sát chất hấp phu ̣ và hê ̣ dung môi rƣ̉a giải.
Hê ̣ dung môi rƣ̉a giải đƣợc thƣ̉ nghiê ̣m là:
n-Hexan, Cloroform, Ethylaxetat, n-Butanol n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol n-Hexan, n-Butanol, Aceton, Nƣớc
Kết quả nghiên cƣ́u sơ bô ̣ thấy chất hấp phu ̣ silicagel và hê ̣ dung môi rƣ̉a giải n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol có thể tách phân đoa ̣n tƣơng đối tốt và phù
hơ ̣p. Do đó ta đi khảo sát quá trình tách phân đoa ̣n di ̣ch chiết táo mèo và di ̣ch lên men trên cô ̣t sắc ký nhồi to hơn.
Phân đoạn di ̣ch chiết trên sắc ký cột
- Nhồi cột: Silicagel đƣợc sấy ở 3000C trong 2h và để nguội trong bình hút ẩm sau đó nhồi cột có đƣờng kính 1cm, chiều cao là 22cm.
- Luyện cột: dùng metanol để hoạt hóa pha rắn, làm ƣớt để pha rắn có thể
sẵn sàng tiếp xúc và tƣơng tác với các chất tan. Tránh không làm khô pha rắn trong và sau khi luyện cột.
- Cân bằng cột: tƣơng tự nhƣ bƣớc 2 (nhƣng phải dùng chính dung mơi chứa mẫu nhƣ ban đầu để cho vào cột) dùng metanol.
- Đưa mẫu vào cột: pha các mẫu cao chiết trong methanol ở nồng đô ̣ 0,01g/ml. Đƣa 5ml dung dịch trên lên cột nhồi.
- Rửa giả i trên cột : dùng hệ dung môi rửa giải là : n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol vớ i tỷ lê ̣ phối trô ̣n khác nhau sao cho mƣ́c đô ̣ phân cƣ̣c tăng dần . Tốc độ dòng điều chỉnh sao cho thời gian tiếp xúc giữa dung môi rửa và pha rắn kéo dài trong 1-2 phút.
Kiểm tra các phân đoa ̣n trên sắc ký bản mỏng để thu gom các phân đoa ̣n có kết quả triển khai tƣơng tƣ̣ nhau trong cùng mô ̣t hê ̣ dung môi có kết quả gần giống nhau.
2.2.7.2. Phương phá p kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng
Sấy bản mỏng rồi cắt thành tƣ̀ng tấm theo kích thƣớc nhất đi ̣nh . Đánh dấu đƣờng xuất phát cách mép dƣới 0,5 –1 cm. Dùng ống mao quản hút dung d ịch mẫu thử rồi chấm lên b ản mỏng. Vết chấm phải tròn, gọn và đƣa đƣợc lƣ ợng mẫu phù hơ ̣p. Sau đó đặt bản mỏng đã chấm vào bình triển khai sắc ký với hê ̣ dung môi triển khai đã đƣ ợc bão hòa, đậy nắp bình. Sau khi dung mơi chạy đến cách đầu trên của bản khoảng 0,5-1 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung mơi trên bản mỏng, sấy khô bản mỏng rồi soi UV hoặc phun các thuốc thử hiện màu nhƣ dung d ịch H2SO4 10% rồi sấy khô cho dung môi bay hết để vết triển khai trên bản mỏng đƣợc hiện rõ.
Các hệ dung môi triển khai đã thử nghiệm khi nghiên cứ u các phân đoa ̣n trên bản mỏng bao gồm:
1. TEAF - Tuluen: Ethylacetae: Acetone: Acid Focmic = 5:3:1:1. 2. Ethylaxetat: axit focmic: nƣớc = 8:1:1
3. Toluen: Ethylaxetat: axit focmic = 5:4:1
4. [Axit acetic (2,4%) – Etanol –Acetonitril (35: 5: 10)] - Metanol : (70: 30) 5. Metanol – Axit acetic – Nƣớc (36,7%: 0,3%: 63%)
6. Axit acetic (0,28%) – Metanol – Acetonitril (35: 5: 10) 7. n-Butanol – Axit acetic – Nƣớc (85: 5: 10)
8. n-Butanol – Etyl acetat – Dimetyl formamit – Nƣớc (10: 6: 3: 2) 9. Toluen – Etyl acetat – Aceton – Axit formic (15: 2: 2: 1)
10. Benzen – Aceton (4:1): Benzen – Pyridin – Axit formic (36: 9: 5)