Rượu được chuyển hóa thành acetaldehyde nhờ hoạt tính enzym của ADH và CYP2E1. Acetaldehyde là một chất có độc tính tiếp tục được chuyển hóa thành một chất khơng độc acetate nhờ ALDH (hình 1.4). Hiện tượng đa hình thái của ADH và ALDH tạo ra các kiểu gen khác nhau có thể gây tích lũy acetaldehyde và dẫn đến sự phát sinh phát triển ung thư.
Gen ALDH2 có các đa hình đơn (SNP) tạo ra các isoenzym có thuộc tính động học khác nhau. Sự thay đổi 2 acid amin tại các vị trí xác định trên gen ALDH2 (exon 12) tạo ra 2 alen đa hình thái là ALDH2*1 và ALDH2*2. Enzym được mã hóa bởi alen ALDH2*1 có Glu ở vị trí 487. Enzym được mã hóa bởi alen ALDH2*2 có Lys ở vị trí 487, là enzym có hoạt tính thấp, gần như bất hoạt trong việc chuyển hoá acetaldehyde thành acetate.
Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên. Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi[64], [32].
Sự đa hình thái của gen mã hóa cho các enzym ALDH2 làmcho các enzym có hoạt tính thay đổi. Alen ALDH2*1 mã hoá enzyme có khả năng oxy hóa acetaldehyd trong khi alen ALDH2*2 mã hố enzyme gần như mất hoạt tính.
Trong một quần thể hay nhiều quần thể khác nhau, thì tốc độ chuyển hóa rượu của từng cá thể khác nhau tùy thuộc cá thể đó mang kiểu gen và alen ALDH2 nào
[9]. Vì vậy, bên cạnh rượu có ảnh hưởng gián tiếp đến tổn thương các tế bào và mô cơ quan trong cơ thể thì yếu tố di truyền là yếu tố nguy cơ quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư.
1.3.4. Gen ALDH2 và bệnh ung thư
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự tác động sự đa hình thái của genALDH2 và lượng rượu tiêu thụ của bệnh nhân có nguy cơ gây ra một số loại ung thư.
- Gen ALDH2 và ung thư đại trực tràng(UTĐTT).
Hua Zhao và cộng sự (2014) cơng bố nghiên cứu phân tích tổng hợp nhiều nghiên cứu khác nhau để tìm mối liên quan đa hình thái Glu487Lys của gen ALDH2 với nguy cơ UTĐTT [72]. Kết quả phân tích 11 nghiên cứu bệnh-chứng trên 2909 bệnh nhân và 4093 người thuộc nhóm chứng cho thấy những người có chứa alen ALDH2*2có nguy cơ UTĐTT thấp hơn.
- Gen ALDH2 và ung thư thực quản
Tác giả Ming Wu và cộng sự (2013) đã so sánh yếu tố nguy cơ của ung thư thực quản liên quan đến mức độ tiêu thụ rượu giữa những người mang kiểu gen
ALDH2*1/*1 với người mang kiểu gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 và đồng hợp tử ALDH2*2/*2. Kết quả nghiên cứu trên 858 bệnh nhân ung thư thực quản và trên nhóm chứng 1081 người Trung Quốc đã cho thấy người uống rượu trung bình - nhiều và mang gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 có nguy cơ mắc ung thư thực quản cao nhất (OR=2,34, 95% CI: 1,52-3,61) so với nhóm người khơng hoặc uống rượu ít có gen đồng hợp tử ALDH2*1/*1[67].
1.4. Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2
1.4.1. Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP)
Hiện tượng SNP hay hiện tượng đa hình đơn Nucleotide là sự khác nhau về trình tự DNA khi một Nucleotide đơn A, C, T hay G trong một chuỗi ADNtương ứng (Hình 1.5) giữa các cá thể của một loài hay giữa các cặp NST của một cá thể.Bộ gen người có 23 cặp NST, trong đó có 22 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính chứa khoảng 3,2 tỷ bp. Kết quả của dự án giải trình tự gen người cho thấy trình tự các nucleotid giống nhau đến 99,9% giữa các cá thể và sự khác nhau ở 0,1% còn lại biểu hiện bằng các đa hình đơn. Chính sự khác nhau này đã quy định đặc điểm riêng của mỗi cá thể, liên quan tính cách, nguy cơ mắc bệnh và sự đáp ứng với điều trị.
SNP là hiện tượng phổ biến theo ngân hàng dữ liệu của NCBI tính đến tháng 26/6/2012 có hơn 53 triệu SNPs ở người, xảy ra tần số khá cao từ 1/1000 bp đến 1/100-300 bp. SNP được coi là hậu quả của đột biến điểm thay thế một cặp Nucleotide.
SNP xảy ra ở cả vùng mã hóa và vùng khơng mã hóa của gen. Các SNP tại vùng mã hố của gen có thể làm thay đổi hoặc khơng làm thay đổi trình tự các acid amin và cấu trúc phân tử protein mà nó tạo ra. Hầu hết các SNP xảy ra ở vùng khơng mã hóa và khơng làm thay đổi cấu trúc của gen, tuy nhiên các SNP có thể nằm ở vùng điều hồ của gen, làm thay đổi mức độ sao chép gen hay ảnh hưởng đến q trình hồn thiện RNA thơng tin.
Dựa vào trình tự acid amin của của phân tử protein do gen tổng hợp có thể chia làm 2 loại
- Biến đổi im lặng là những biến đổi khơng làm thay đổi sản phẩm gen, ví dụ bộ ba mã hóa GAC và GAG đều mã hóa cho acid amin leucine, khơng thay đổi cấu trúc phân tử protein.
- Biến đổi sai nghĩa là những biến đổi làm thay đổi trình tự chuỗi polynucleotide của ARN, do đó làm thay đổi trình tự chuỗi acid amin của phân tử
protein. Thông thường những biến đổi dạng này làm thay thế một acid amin bằng acid amin khác.
Những đột biến trên có thể dẫn tới sự thay đổi chức năng gen. Các dạng biến đổi này có thể xảy ra ở bất kỳ bộ ba mã hố nào cũng như tại các vị trí cắt, ghép nối extron và intron.
Ngoài ra, SNP trong vùng mã hóa, làm thayđổi cấu trúc phân tử protein ở nhiều mức độ khác nhau. Ví dụ nếu SNP làm cho mã GAU thành GAG thay đổi acid amin từ aspartic thành glutamic, hai acid amin này có tính chất hóa học rất giống nhau. Nếu SNP này chỉ làm thay đổi một phần protein và không phải quan trọng với chức năng của nó, thì kết quả hồn tồn vô hại. Trong điều kiện bình thường sự thay đổi SNP là tiềm ẩn, nhưng chỉ khi tiếp xúc với các tác nhân có hại mơi trường như chất gây ung thư, hóa chất…thì chúng hoạt hóa và biểu hiện bệnh.
Như vậy sự khác biệt trong trình tự DNA ở người có thể ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh tật, sự đáp ứng với tác nhân gây bệnh, hóa chất, thuốc, và vacxin và các tác nhân khác. Do đó, ứng dụng lớn nhất của SNP trong nghiên cứu y sinh học là so sánh các vùng gen giữa các nhóm đối tượng khác nhau (nhóm người khơng bị bệnh và nhóm người bị bệnh) để từ đó tìm ra mối liên quan giữa SNP với bệnh, từ đó tìm ra yếu tố nguy cơ đối với sự hình thành và tiến triển bệnh.
SNP và mối liên quan đến ung thư
Hiện nay các nhà khoa học đang cố gắng xác định SNP khác nhau trong bộ gen con người, và thiết lập hồ sơ SNP cho mỗi cá thể và xếp chúng theo nhóm (SNP profiles). SNP profiles có thể giúp xác định gen ung thư, và xác định yếu tố nguy cơ có liên quan đến ung thư trong các quần thể lớn.
Hình 1.5. Minh họa hiện tƣợng đa hình đơn nucleotide(SNP)
Nguồn SNP - Google Search.htm
1.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn nucleotide:
1.4.2.1. Kỹ thuật PCR
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotide tự do. Phản ứng này địi hỏi sự có mặt của những mồi xi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước như sau:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,
Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động xúc tác quá trình tổng hợp tốt nhất.
Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm khuôn mẫu để tổng hợp các đoạn DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là các đoạn DNA chuỗi đơi có chiều dài xác định là khoảng