KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men

Để nghiên cứu q trình thủy phân tinh bợt, bước đầu tiên các chủng nấm mốc được phân lập từ 15 mẫu bánh men thì kết quả là hầu hết các chủng nấm mốc đều thuộc họ Mucoraceae.

Bằng việc phân lập, quan sát hình thái khuẩn lạc, làm sạch các chủng vi nấm khác nhau từ 15 mẫu bánh men được thu thập từ các tỉnh Ninh Bình, Tun Quang, Thái Bình, Hà Nợi, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, Bắc Giang, có 73 chủng nấm mốc, 16 chủng nấm men và 12 chủng giả nấm men. Thông tin chi tiết chủng được ghi rõ trong phụ lục.

Tổng số chủng được phân lập từ 15 mẫu bánh men là 101, trong đó chủ yếu là nấm mốc chiếm 73 chủng, nấm men 16 chủng và giả men chỉ có 12 chủng. Nấm mốc xuất hiện ở tất cả các bánh men, từ 2 đến 8 chủng trên một bánh. Tuy nhiên, các chủng nấm men phân lập được chỉ xuất hiện ở bánh men MQ2, MQ3, MQ4, MQ7, MQ8, MQ9, MQ11, MQ12, MQ13 mà không phân lập được ở bánh men MQ1, MQ5, MQ6, MQ10, MQ14, MQ15. Đối với các chủng giả men cũng vậy, chỉ xuất hiện ở bánh men MQ2, MQ3, MQ7, MQ8, MQ9, MQ12, MQ13, MQ14 mà không có ở bánh men MQ1, MQ4, MQ5, MQ6, MQ10, MQ11, MQ15.

3.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào.

Sau khi phân lập, các chủng cần được xếp nhóm trong đó phân nhóm hình thái khuẩn lạc và tế bào là một bước rất quan trọng. Các chủng được cấy trên đĩa Petri Malt 2ºBx, sau 2 ngày nuôi trong tủ 30ºC sẽ được xếp nhóm sơ bợ bằng hình thái khuẩn lạc dựa trên 3 đặc điểm cơ bản của khuẩn lạc là: hình dạng, kích thước, màu sắc. Sau đó, tiếp tục làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi. Dưới đây là hình thái kh̉n lạc mặt trước, mặt sau và hình thái tế bào (thứ tự từ trái sang phải) của các chủng vi nấm đại diện các nhóm.

Nhóm 1 (18 chủng): Rhizopus microsporus MQF 4.2

Nhóm 2(8 chủng): Rhizopus microsporus MQF 1.2

Nhóm 3 (3 chủng): Mucor indicus MQF 12.1

Nhóm 5 (7 chủng): Rhizopus oryzae MQF 2.5

Nhóm 6 (4 chủng): Rhizopus oryzae MQF 1.3

Nhóm 7 (12 chủng): Rhizopus oryzae MQF 10.5

Nhóm 10(4 chủng): Mucor circinelloides MQF 2.2

Nhóm 11 (5 chủng): Mucor indicus MQF 8.4

Nhóm 12 (2 chủng): Mucor indicus MQF 10.2

Nhóm 13 (2 chủng): Cunninghamella echinulata MQF 8.6

Nhóm 1(14 chủng): Saccharomyces cerevisiae MQY 4.1

Nhóm 2 (2 chủng): Wickerhamomyces anomalus MQY 11.3

Nhóm giả men

Có 12 chủng. Saccharomycopsis fibuligera MQS 14.1

Hình 3. 1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện Nấm mốc:

Nhóm 1 (18 chủng): Nhóm này có hình thái kh̉n lạc màu xám ghi, hệ sợi phát triển nhanh, túi bào tử màu đen. Dễ thấy, nhóm khuẩn lạc này rất phổ biến, chúng xuất hiện ở hầu hết các bánh men từ MQ4 đến MQ15.

Nhóm 2 (8 chủng): Nhóm này đặc trưng bởi hình thái khuẩn lạc màu đen, hệ sợi bò lan, ít hoặc không có hệ sợi khí, bào tử đen to. Khi quan sát tiêu bản có rễ. Nhóm này cũng khá phổ biến, chúng xuất hiện ở 7 bánh men MQ 1,4,5,6,10,11,14.

Nhóm 3 (3 chủng): Khuẩn lạc màu sáng, hệ sợi dày bò lan, không có hệ sợi khí. Khi quan sát tế bào có nhiều Chlamydospore. Nhóm này tần xuất xuất hiện thấp, chỉ có mặt ở bánh men MQ3, MQ12, và MQ14.

Nhóm 4 (5 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa phát triển nhanh, hệ sợi bò lan là chủ yếu, không vách ngăn, dường như không quan sát thấy túi bào tử. Khi làm tiêu bản để quan sát tế bào thì thấy rất nhiều Chlamydospore ở giữa sợi nấm. Nhóm này chỉ xuất hiện ở 4 bánh men duy nhất là MQ2,3,7,8

Nhóm 5 (7 chủng): Hệ sợi màu trắng, bò lan và cả sợi khí phát triển tốt. Túi bào tử to, màu trắng, hệ sợi không vách ngăn, và không quan sát thấy rễ nấm. Nhiều Chlamydospore giữa sợi nấm. Các chủng thuộc nhóm này được tìm thấy ở MQ2, MQ9, MQ12, và MQ15.

Nhóm 6 (4 chủng): Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, phát triển nhanh, vừa bò lan vừa có hệ sợi khí, túi bào tử lớn màu đen có thể nhìn thấy bằng mắt thường, khi già khuẩn lạc nhìn có màu hơi nâu. Nhóm này chỉ thấy ở 3 bánh men là MQ1, MQ5 và MQ7

Nhóm 7 (12 chủng): Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, phát triển nhanh, chủ yếu bò lan, hệ sợi khí mọc thưa, túi bào tử lớn màu đen, ít hơn nhưng to hơn bào tử ở nhóm 6, có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Sợi có nhiều Chlamydospore. Các chủng thuộc nhóm này xuất hiện ở nhiều các bánh men như MQ2,4,5,6,10,11,14

Nhóm 8 (3 chủng): Khuẩn lạc màu trắng điển hình, sợi mảnh, hệ sợi khí phát triển tốt. Túi bào tử hình cầu. Nhóm này xuất hiện khá ít, chỉ ở 3 bánh men MQ9,11,14.

Nhóm 9 (1 chủng): Nhóm này duy nhât phân lập được 1 chủng, xuất hiện ở bánh men MQ12. Khuẩn lạc màu trắng xốp, sợi mảnh, bào tử đính tròn nhỏ.

Nhóm 10 (4 chủng): Khuẩn lạc màu đậm đặc trưng, hệ sợi dày, Túi bào tử hình cầu. Các chủng tḥc nhóm này được phân lập từ 3 bánh men là MQ2,3,13.

Nhóm 11 (5 chủng): Các chủng thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu vàng ghi đặc trưng, Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tục phân nhánh, với các nhánh dài. Túi bào tử có màu vàng đến nâu. Cuống gần hình cầu, cao. Bào tử có vách trơn,

gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm. Các chủng tḥc nhóm này tḥc các bánh men MQ1,8,9.

Nhóm 12 (2 chủng): Khuẩn lạc màu vàng nhạt, sợi mọc lan, ở giữa có ít sợi khí mọc lên, bào tử. Túi bào tử to, hình tròn đính với cuống lớn hình trụ, bào tử nhỏ hình gần cầu, elip. Nhóm này rất hiếm gặp, chỉ thấy ở bánh men MQ10.

Nhóm 13 (2 chủng): Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, hệ sợi phát triển chậm, bào tử đính hình tròn. Chỉ duy nhất bánh men MQ8 có sự xuât hiện nhóm chủng này.

Nấm men:

Nhóm 1: (13 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa, nhẵn bóng, tế bào gần cầu, có những tế bào dài đang phân đôi. Nhóm chủng này rất phổ biến, xuất hiện ơ nhiều bánh men như MQ2,3,4,7,8,9,11,12,13.

Nhóm 2 (2 chủng): Khuẩn lạc có màu trắng sáng, sáng hơn nhóm 1, tế bào tròn, nhiều tế bào quan sát được đang phân đôi, nảy chồi. Nhóm này chỉ có 2 chủng duy nhất thuộc 2 bánh men MQ9 và MQ11.

Giả men:

Nhóm 1 (12 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa, xù xì. Khi quan sát tế bào thì có nhiều sợi và bào tử

Như vậy, kết quả cho thấy hầu hết các chủng vi nấm được phân lập là nấm mốc với độ đa dạng về hình thái khuẩn lạc và tế bào hơn là nấm men và giả nấm men.

3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện dựa vào phân tích trình tự rDNA

Việc phân loại bước đầu các chủng nấm mốc bằng hình thái khuẩn lạc và tế bào tương đối nhanh do sự sai khác khá điển hình giữa các nhóm. Tuy nhiên, với các chủng nấm men hay giả men thì do sự đa dạng và sự sai khác khơng rõ ràng giữa các chủng về mặt hình thái khuẩn lạc cũng như tế bào làm cho việc phân loại dựa vào những đặc điểm này gặp nhiều khó khăn, phân nhóm bằng hình thái là mợt bước để giảm bớt sự khó khăn khi phân nhóm bằng các phương pháp tiếp theo. Để đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập được mợt cách chính xác, chúng tơi tiến hành phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 103 chủng phân lập được sử dụng mồi MST2

(có trình tự 5’-(GAC)5-3’). Kết quả phân nhóm bằng fingerprinting được đối chiếu lại với kết quả phân nhóm bằng hình thái.

Hình 3. 2. Phở băng DNA fingerprinting

Ký hiệu: 1-MQF 4.2; 2- MQF 4.4; 3- MQF 5.2; 4 - MQF 5.6; 5 - MQF 6.4; 6 - MQF 6.5; 7 - MQF 7.2; 8 - MQF 8.3; 9 - MQF 9.5; 10 - MQF 10.3; 11 - MQF 11.1; 12 - MQF 12.5; 13 - MQF 14.3; 14 - MQF 14.7; 15 - MQF 14.8; 16 - MQF 15.3; 17 - MQF 10.1; 18 - MQF 13.1; 19 - MQF 1.2; 20 - MQF 4.1; 21 - MQF 4.5; 22 - MQF 5.3; 23 - MQF 6.3; 24 - MQF 10.4; 25 - MQF 11.2; 26 - MQF 14.1; 27 - MQF 3.1; 28 - MQF 12.1; 29 - MQF 12.4; 30 - MQF 2.4; 31 - MQF 3.2; 32 - MQF 8.2; 33 - MQF 2.5; 34 - MQF 9.1; 35- MQF 9.6; 36 - MQF 12.6; 37 - MQF 15.1; 38 - MQF 15.2; 39 - MQF 15.4; 40 - MQF 1.3; 41 - MQF 1.4; 42 - MQF 5.7; 43 - MQF 7.1; 44 - MQF 7.3; 45 - MQF 8.1; 46 - MQF 2.1; 47 - MQF 4.3; 48 -MQF 5.1; 49 - MQF 5.4; 50 - MQF 5.5; 51 - MQF 6.1; 52 - MQF 6.2; 53 - MQF 10.5; 54 - MQF 10.6; 55 - MQF 14.4; 56 - MQF 14.5; 57 - MQF 9.4; 58 - MQF 11.3; 59 - MQF 14.2; 60 - MQF 12.2; 61 - MQF 2.2; 62 - MQF 2.3; 63 - MQF 3.3; 64 - MQF 13.2; 65 - MQF 1.1; 66 - MQF 8.4; 67 - MQF 8.7; 68 - MQF 9.3; 69- MQF 9.7; 70 - MQF 10.2; 71 - MQF 10.7; 72 - MQF 8.5; 73 - MQF 8.6; 74- MQY 2.1; 75- MQY 3.1; 76- MQY 4.1; 77- MQY 4.2; 78- MQY 7.2; 79- MQY 8.1; 80- MQY 8.2; 81- MQY 9.2; 82- MQY 11.1; 83- MQY 11.2; 84- MQY 12.1; 85- MQY 12.2; 86- MQY 13.1; 87- MQY 7.1; 88- MQY 9.3; 89- MQY 11.3; 90- MQS 8.1; 91- MQS 8.2; 92- MQS 3.2; 93- MQS 3.1; 94- MQS 2.2; 95- MQS 2.1; 96- MQS 12.1; 97- MQS 12.2; 98- MQS 13.2; 99- MQS 13.1; 100- MQS 9.2; 101- MQS 14.1.

Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR nhân với mồi MST2 của các chủng nấm có các phở băng khác nhau và rất đa dạng do sự phân bố về số lượng bản sao cũng như vị trí của DNA vệ tinh trong genome. Kỹ thuật phân nhóm sử dụng mồi thiết kế dựa trên DNA vệ tinh cho độ phân giải đến lồi. Các chủng có cùng hình thái khuẩn lạc, được điện di cạnh nhau, và cho phổ finger giống nhau như nhóm 1, nhóm 2, nhóm 3. Bên cạnh đó, các chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau nhưng lại cho cùng phổ finger như các chủng thuộc nhóm 4,5,6,7. Tùy thuộc vào vị trí phân bố trên DNA mà số lượng vạch DNA giữa các nhóm có thể khác nhau, ví dụ như nhóm 6,7,8 có nhiều băng DNA nhưng nhóm 9 hay 13 chỉ có 1 băng DNA duy nhất. Các chủng vừa có hình thái giống nhau, vừa có băng finger giống nhau sẽ được xếp cùng nhóm. Theo cách đó chúng tôi đã chia 73 chủng nấm mốc thành 13 nhóm, 16 chủng nấm men thành 2 nhóm, và 12 chủng giả nấm men.

Bảng 3. 1. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting và đọc trình tự các chủng đại diện

Nhóm Chủng

Chủng đọc trình

tự

Tên khoa học

Nấm mốc 1 (18 chủng) MQF 4.2, MQF 4.4, MQF 5.2, MQF 5.6, MQF 6.4, MQF 6.5, MQF 7.2, MQF 8.3, MQF 9.5, MQF 10.3, MQF 11.1, MQF 12.5, MQF 14.3, MQF 14.7, MQF 14.8, MQF 15.3, MQF 10.1, MQF 13.1 MQF 4.2 Rhizopus microsporus 2 (8 chủng) MQF 1.2, MQF 4.1, MQF 4.5, MQF 5.3, MQF 6.3, MQF 10.4, MQF 11.2, MQF 14.1 MQF 5.3 Rhizopus microsporus 3 (3 chủng) MQF 3.1, MQF 12.1, MQF 12.4 MQF 12.1 Mucor indicus 4 (5 chủng) MQF 2.4, MQF 3.2, MQF 7.3, MQF 8.1, MQF 8.2 MQF 2.4 Rhizopus oryzae 5 (7 chủng) MQF 2.5, MQF 9.1, MQF 9.6, MQF 12.6, MQF 15.1, MQF 15.2, MQF 15.4 MQF 2.5 Rhizopus oryzae

6 (4 chủng) MQF 1.3, MQF 1.4, MQF 5.7, MQF 7.1 MQF 1.3 Rhizopus oryzae

7 (11 chủng) MQF 2.1, MQF 4.3, MQF 5.1, MQF 5.4, MQF 5.5, MQF 6.1, MQF 6.2, MQF 10.5, MQF 10.6, MQF 14.4, MQF 14.5 MQF 10.5 Rhizopus oryzae

Nhóm Chủng

Chủng đọc trình

tự

Tên khoa học

9 (1 chủng) MQF 12.2 MQF

12.2

Cunninghamella bertholletiae

10 (3 chủng) MQF 2.2, MQF 2.3, MQF 3.3 MQF 2.2 Mucor circinelloides

11 (6 chủng) MQF 13.2, MQF 1.1, MQF 8.4, MQF 8.7, MQF 9.3, MQF 9.7 MQF 8.4 Mucor indicus 12 (2 chủng) MQF 10.2, MQF 10.7 MQF 10.2 Mucor indicus 13 (2 chủng) MQF 8.5, MQF 8.6 MQF 8.6 Cunninghamella echinulata Nấm men 1

(14 chủng) MQY 2.1, MQY 3.1, MQY 4.1, MQY

4.2, MQY 7.2, MQY 8.1, MQY 8.2, MQY 9.2, MQY 11.1, MQY 11.2, MQY 12.1, MQY 12.2, MQY 13.2, MQY 7.1

MQY 4.1 Saccharomyces

cerevisiae

2 (2 chủng) MQY 9.3, MQY 11.3 MQY

11.3 Wickerhamomyces anomalus Giả men 1 (12 chủng) MQS 8.1, MQS 8.2, MQS 3.2, MQS 3.1, MQS 2.2, MQS 2.1, MQS 12.1, MQS 12.2, MQS 13.2, MQS 13.1, MQS 9.2, MQS 14.1 MQS 14.1 Saccharomycopsis fibuligera

Xếp nhóm và phân loại các chủng dựa vào hình thái và đặc điểm sinh lý thường rất khó và tốn thời gian. Các loài khác nhau có thể có hình thái giống nhau và các chủng cùng loài có thể có nhiều kiểu hình. Bằng việc sử dụng mồi PCR (GAC)5 khuếch đại các đoạn ADN vệ tinh có thể xếp nhóm thành công một lượng lớn các chủng vi nấm.

Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting chúng tơi chọn ra 16 chủng đại diện của 16 nhóm (bảng 3.2) để phân tích trình tự. Chúng tơi chọn đoạn D1/D2 của rDNA 26S và vùng ITS của rDNA để phân tích. Do kích thước của các đoạn này khá ngắn (khoảng 600 bp), tính bảo thủ rất cao giữa các lồi. Đồng thời, trình tự của các đoạn này của các loài đã biết đã được công bố trên GenBank, nên dễ dàng cho việc so sánh trình tự với các lồi mới phân lập được. Như vậy với các ưu điểm này, đoạn D1/D2 và vùng ITS rất thích hợp cho việc phân tích trình tự để định tên nấm

DNA của 13 chủng nấm mốc được tách sau đó dùng PCR nhân đặc hiệu đoạn DNA chứa vùng ITS, nấm men, giả nấm men nhân đoạn D1/D2 bằng cặp mồi ITS1 và NL4. Sản phẩm PCR sau đó được tinh chế và đọc trình tự với mồi ITS4 (nấm mốc), NL4 (nấm men, giả men). Kết quả đọc trình tự sau đó được so sánh với các chủng đã được công bố.

Từ kết quả đọc trình tự các chủng đại diện ở bảng 3.2, ta thấy đối với các chủng nấm mốc.

- Loài Rhizopus oryzae, chiếm 27 chủng (tởng của 5 chủng nhóm 4, 7 chủng

nhóm 5, 4 chủng nhóm 6 và 11 chủng nhóm 7).

- Lồi Rhizopus microsporus chiếm 26 chủng (tởng của 26 chủng nhóm 1 và

8 chủng nhóm 2)

- Lồi Mucor indicus chiếm 11 chủng (3 chủng nhóm 3, 6 chủng nhóm 11 và

2 chủng nhóm 12)

- Lồi Mucor circinelloides có 3 chủng (3 chủng nhóm 10)

- Lồi Lichtheimia ramosa có 3 chủng (3 chủng nhóm 8), lồi Cunninghamella echinulata có 2 chủng, và 1 chủng Cunninghamella bertholletiae.

Từ đó có thể kết luận rằng, loài nấm mốc thường gặp ở các bánh men là

Rhizopus oryzae, chiếm 27 chủng trong số 73 chủng nấm được xác định và tiếp theo

là Rhizopus microsporus (26 chủng), Mucor indicus (11 chủng), Mucor circinelloides

(3 chủng), Lichtheimia ramosa (3 chủng), Cunninghamella echinulata (2 chủng),

Cunninghamella bertholletiae (1 chủng). Trong 1 nghiên cứu trước về đa dạng vi sinh

vật trong bánh men truyền thống thì các chủng nấm tḥc họ Mucoraceae khơng phở biến mà loài nấm giả men Saccharomyscopsis fibuligera mới là loài phổ biến hơn cả

[21]. Saccharomyscopsis fibuligera cũng là loài sinh amylase chính ở Loog-pang –

một loại giống khởi động truyền thống ở Thái Lan, tương tự như bánh men Việt Nam. Trong số các chủng nấm men phân lập được thì chủ ́u các chủng tḥc loài

S.cerevisiae (14 chủng-nhóm 1), Wickerhamomyces anomalus (2 chủng-nhóm 2), và

12 chủng giả nấm men. S. fibuligera. Một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng loài nấm S. cerevisiae đóng vai trò chủ yếu trong quá trình lên men rượu vì chúng được tìm thấy ở tất cả các giai đoạn của quá trình lên men và đến ngày cuối cùng thì chỉ có

sự hiện diện thuần nhất của chúng bên cạnh vi khuẩn, đây được giải thích là kết quả của việc thuần hóa lâu dài [25].

Kết quả phân lập này tương đồng với nghiên cứu trước đây của Thanh VN và cộng sự, từ 130 chủng vi nấm được phân lập từ các giai đoạn khác nhau của lên men

rượu gạo. Trong đó, 41 chủng thuộc họ Mucoraceae, 16 chủng giả men là S

.fibuligera, 29 chủng nấm men, chủ yếu là S.cerevisiae [25].