Thiết bị Dụng cụ

CHƢƠNG II NGUYÊN LIỆUVÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Thiết bị Dụng cụ

Các thiết bị sử dụng để đánh giá quá trình lên men: máy đo pH, thiết bị cất đạm, máy đo hoạt độ nước, máy đo cấu trúc...Các thiết bị cơ bản của phịng phân tích vi sinh vật. Tất cá các thiết bị đều được Tổng cục đo lường chất lượng hiệu chuẩn định kỳ đảm bảo độ chính xác và ổn định. Tất cả các dụng cụ đo thể tích đều được hiệu chuẩn trước khi sử dụng

- Thiết bị cắt; Thiết bị xay nhuyễn; Thiết bị nhồi định hình

- Tủ ổn nhiệt ổn ẩm duy trì được các khoảng nhiệt độ/độ ẩm nghiên cứu - Lị vi sóng; Máy vơ cơ hóa; Máy cất đạm; Thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp)

- Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 37± 1oC, 42± 1oC, 45± 1oC

- Nồi cách thủy hoặc thiết bị tương tự, duy trì được nhiệt độ từ 440C đến 470C

- Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25oC; Máy đồng nhất mẫu

- Các dụng cụ cơ bản của phịng phân tích vi sinh vật và hóa thực phẩm

2.4 . Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1 . Phương pháp vi sinh

Sử dụng các phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm để đánh giá sô lượng các vi sinh vật trong mẫu thử trước và sau khi cho lên men, làm khơ và làm chín ở các chế độ nhiệt, độ ẩm...khác nhau (biện pháp can thiệp).

- Định lượng S.aureus theo TCVN 4830-1:2005 (ISO 6888-1:2003)

Nguyên tắc: đếm số lượng khuẩn lạc điển hình (sinh lecithinase phân giải lecithin) trên mơi trường Baird Parker có bổ sung kali tellurit và nhũ tương lịng đỏ

trứng khi ủ ở 35 hoặc 370C/24 - 48h và có phản ứng đơng huyết tương dương tính

trong phép thử khẳng định để tính ra số CFU/g sản phẩm

Trên mỗi đĩa, tính số lượng a các staphylococci có phản ứng dương tính với

coagulase đã được nhận dạng, theo cơng thức:

nc nc nc c c c xc A b xc A b a  Trong đó

Ac là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase

Anc là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase

bc là số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase; bnclà số lượng khuẩn lạc khơng điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với

coagulase;

cc là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa

cnclà tổng số khuẩn lạc khơng điển hình nhìn thấy trên đĩa

Lấy kết quả tròn số

Số lượng S.aureus trong mấu thử được tính bằng cơng thức:

a

Trong đó:

a là tổng số khuẩn lạc có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận biết

trên tất cả các đĩa đã chọn.

V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit; n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất; n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai;

d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền

phù ban đầu là một độ pha loãng).

Biểu thị kết quả dưới dạng log CFU/g

- Phát hiện Salmonella spp. theo TCVN 4829: 2005 (ISO 6579:2002)

Nguyên tắc: mẫu thử được tăng sinh lần lượt trong canh thang không chọn lọc (ủ ở 370C ±10C), canh thang tăng sinh chọn lọc (ủ ở 41,5°C ± 1°C trong 24 h  3 h với môi trường RSV và ủ ở 37°C ± 1°C trong 24 h ± 3 h với môi trường MKTTn). Sau đó mẫu thử trong canh thang tăng sinh chọn lọc được cấy lên hai môi trường thạch chọn lọc để chọn các khuẩn lạc điển hình thử khẳng định sinh hóa và ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu.

Tiêu chuẩn khẳng định sinh hóa: Glucose (+), lactose (-), sucrose (-), H2S (+), ure (-), β galactosidase (-), VP (-), Indol (-), Lysindecacboxylase (+)

Tiêu chuẩn khẳng định huyết thanh: không tự ngưng kết với nước muối sinh lý, ngưng kết kháng nguyên O (+), H(+/-) hoặc Vi (+/-)

- Phát hiện Listeria monocytogenes theo TCVN 7700-1 : 2007

Nguyên tắc: tăng sinh trong môi trường chọn lọc nồng độ pha lỗng ½, ủ ở

300C/24 giờ và nồng độ nguyên, ủ ở 35 hoặc 370C/48 giờ, sau đó cấy lần lượt lên

các mơi trường thạch chọn lọc, ủ ở nhiệt độ/thời gian thích hợp để chọn các khuẩn lạc điển hình thử khẳng định sinh hóa [tan máu cừu dạng β, xylose (-), Rhamnose (+), CAMP test: S.aureus (+), R.equi (-)].

- Phát hiện và định lượng Lactobacillus theo TCVN 7849: 2008 (ISO

20128:2006)

Nguyên tắc: đếm khuẩn lạc Lactobacillus điển hình trên mơi trường chọn lọc

Tiến hành theo phương pháp cấy trải trên thạch đĩa MRS, ủ kỵ khí ở 370C trong 72h  3h. Tính số lượng Lactobacillustheo công thức sau:

d n n c N ) 1 , 0 ( 1 2   Trong đó:

c là tổng số khuẩn lạc điển hình đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại:

n1 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất; n2 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại. Biểu thị kết quả dưới dạng log CFU/g

- Phát hiện và định lượng Enterobacteriaceae theo TCVN 5518-2:2007 (ISO 21528-2:2004)

Nguyên tắc: đếm các khuẩn lạc điển hình (màu hồng, đỏ hoặc đỏ tía, có quầng đục hoặc không) khi cấy một lượng mẫu thử xác định trên mơi trường thạch đĩa chọn lọc VRBG, ủ hiếu khí ở 37oC (hoặc 30oC) trong 24h ± 2h. và có phản ứng sinh hóa phù hợp trong phép thử khẳng định để tính ra sốCFU Enterobacteriaceae/g sản phẩm.

Tiến hành theo phương pháp cấy trộn và có lớp thạch phủ. Ủ ở 37oC trong 24

h ± 2h.

Thử khẳng định sinh hóa: Phản ứng oxydase (-); lên men glucose (+)

Biểu thị kết quả dưới dạng log CFU/g

- Định lượng E.coli theo TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001)

Nguyên tắc: đếm các khuẩn lạc có màu xanh điển hình (β- glucoronidase dương tính) khi cấy một lượng mẫu thử xác định trên môi trường thạch đĩa chọn lọc TBX và ủ hiếu khí ở 44oC ± 1oC từ 18 - 24 giờ để tính ra số CFU E.coli/g sản phẩm.

Tiến hành theo phương pháp cấy trộn trong môi trường TBX, ở 44 ± 10C từ

18- 24h.

Tính kết quả theo cơng thức: n 0,1n  d V a N 2 1    

Trong đó:

a: tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độ pha lỗng liên tiếp có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh;

n1: số đĩa được giữ lại tại độ pha lỗng thứ nhất;

V: thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit; n2: số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai;

d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d = 1 trong trường hợp (các mẫu ở dạng lỏng) khi mẫu thử được cấy trực tiếp]

Biểu thị kết quả dưới dạng logCFU/g

- Đếm tổng số bào tử nấm men - mốc theo TCVN 8275-1,2:2010 (ISO

21527-1,2:2008)

Nguyên tắc: đếm các khuẩn lạc nấm men - mốc điển hình khi cấy trên bề mặt

thạch đĩa chọn lọc Sabouraund và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 25 ± 10C/5 ngày để

tính ra số lượng bào tử nấm men - mốc/g sản phẩm

Tính tổng số bào tử nấm men - mốc/g sản phẩm theo công thức

n 0,1n  d V a N 2 1     Trong đó:

a: tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độ pha loãng liên tiếp

n1: số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ nhất;

V: thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit; n2: số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai;

d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d = 1 trong trường hợp khi mẫu thử được cấy trực tiếp(mẫu dạng lỏng)]

Biểu thị kết quả dưới dạng log CFU/g

2.4.2 . Phương pháp hóa lý

Sử dụng các phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý trong thực phẩm để đánh giá các thông số thể hiện hiệu quả của quá trình lên men.

- Đo pHtheo H.HD.QT. 070

pH met có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 250C, độ tái lặp ≤ 0,05 đơn vị pH

với các dung dịch đệm pH chuẩn 3,4,5,7,10

Xay nhuyễn 50g mẫu xúc xích cho vào cốc định mức 250 ml.Thêm 100ml nước cất và lắc đều. Đo giá trị pH của mẫu, đọc kết quả tới 0,05 đơn vị pH gần nhất. Để thu được kết quả chính xác, cần đảm bảo nhiệt độ dung dịch chuẩn và mẫu giống nhau.

Việc đo pH được tiến hành ở nhiệt độ phòng (từ 21 - 260C)

- Xác định độ ẩm theo TCVN 8135:2009

Nguyên tắc: Trộn kỹ phần mẫu thử với cát và sấy ở 103°C ± 2°C đến khối lượng khơng đổi, cân chính xác đến 0,001g.

Kết quả:Độ ẩm, w, tính bằng phần trăm khối lượng, theo cơng thức

% 100 1 2 1     o m m m m w Trong đó

mo: khối lượng (g) của đĩa, đũa và cát;

m1: khối lượng (g) của đĩa cùng với phần mẫu thử, đũa và cát trước khi sấy; m2 là khối lượng (g) của đĩa cùng với phần mẫu thử, đũa và cát, sau khi sấy;

Kết quả được làm tròn đến một chữ số thập phân.

- Xác định hàm lượng nito ammoniac ( NH3) - TCVN 3706:1990

Nguyên tắc: Dùng kiềm nhẹ đẩy amoniac ra khỏi mẫu thử, chưng cất vào dung dịch axit sunfuric. Dựa vào lượng axit dư khi chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N để tính hàm lượng amoniac.

Hàm lượng nitơ amoniac (X9) tính bằng phần trăm, theo cơng thức: X9 = m 50 100 250 0,0014 ) 2 V 1 (V      Trong đó:

V1: Thể tích dung dịch (ml) natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng V2: Thể tích dung dịch (ml) natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử

m: Khối lượng mẫu thử (g)

250: Thể tích dịch pha lỗng mẫu thử (ml)

50: Thể tích dịch lọc đã pha loãng lấy xác định (ml) 100: Hệ số tính ra phần trăm.

2.4.3 .Phương pháp thực nghiệm

Để tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tất cả các vi sinh vật trong thịt phát triển và có kết quả khách quan sau nghiên cứu can thiệp, chúng tơi lựa chọn sản xuất xúc xích có đường kính vừa phải (30 mm).

- Nguyên liệuvà phối trộn

 Nguyên liệu chính: thịt lợn nạc 60%; thịt bị nạc 15%; thịt mỡ lợn 25%

 Nguyên liệu phụ: muối ăn 1,6%; NaNO2 200ppm (0,02%); sodium triphosphat

(STPP) 0,3%; ethyobat 0,07%; Glucose 0,8%; Bột tỏi 1%; Bột ớt 0,6%; Bột tiêu 0,5%; mì chính 0,4%, Bột khói 0,2%.

 Chủng giống khởi động: chúng tôi sử dụng hỗn hợp của chế phẩm H.140 (Lactobacillus plantarum)và chế phẩm TM1 gồm 3 chủng (Lb. sakei, S. carnosus,

S. xylosus) với tỷ lệ 70/30 bổ sung vào nguyên liệu đã trộn ở trên để đạt mức 106

CFU/g. Đây là mật độ vi khuẩn Lactobacillus thuận lợi cho quá trình lên

men.Lactobacillus sakei sinh tổng hợp enzym phân giải protein như

aminopeptidase, tripeptidase và dipeptidase. S.carnosus và S.xylosus tham gia vào

việc tạo hương [1.5.1]qua con đường dị hóa các carbonhydrate và aminoacid hình thành nên các ester và tương tác với các axit béo, ngồi ra cịn sản sinh enzym tham gia quá trình khử nitrat thành nitrit tạo màu đỏ hồng đẹp cho sản phẩm.

- Lên men, làm khơ, làm chín

Việc lựa chọn chế độ lên men, làm khơ và làm chín dựa theo hướng dẫn trong quy trình sản xuất xúc xích lên men bán khơ [mục 1.10], tuy nhiên với khoảng nhiệt

độ lên men từ 20 - 250C, chúng tôi lựa chọn 3 khoảng nhiệt độ ở giữa mà không

chọn nhiệt độ thấp nhất và cao nhất để đảm bảo hiệu quả lên men. Với chế độ làm chín, nhiệt độ ban đầu là 220C, sau đó giảm xuống 16 - 180C, chúng tôi lựa chọn 3

chúng tôi lựa chọn các mức nhiệt độ giảm từ 90% - 80% (giảm từ từ)so với giảm từ 92-75% (giảm nhanh).

 Lên men, làm khơ làm chín xúc xích ở 3 chế độ nhiệt độ với cùng RH

 Chế độ 1: 20oC/14oC: lên men ở 20oC trong 4 ngày, sau đó làm khơ làm

chín ở 14oC trong 16 ngày tiếp theo với độ ẩm tương đối khơng khí giảm dần từ 92-

90-87-84-80%.

 Chế độ 2: 22oC/16oC: lên men ở 22oC trong 4 ngày,sau đó làm khơ làm chín

ở 16oC trong 16 ngày tiếp theo với độ ẩm tương đối khơng khí giảm dần từ 92-90-

87-84-80%.

 Chế độ 3: 25oC/18oC: lên men ở 25oC trong 4 ngày, sau đó làm khơ làm

chín ở 18oC trong 16 ngày tiếp theo với độ ẩm tương đối khơng khí giảm dần từ 92-

90-87- 84-80%.

 Lên men, làm khơ làm chín xúc xích ở 2 chế độ nhiệt với RHkhác nhau

Mục đích nghiên cứu này là nhằm đánh giá chất lượng của sản phẩm cuối cùng.

 Tiến hành làm khơ làm chín xúc xích lên men bán khô (sau 4 ngày lên men)

với 2 chế độ của độ ẩm tương đối khơng khíđể lựa chọn chế độ giảm độ ẩm tương đối khơng khí phù hợp

 RH/CĐ 1: Độ ẩm khơng khí giảm dần từ 92-90 - 87 - 84-80%  RH/CĐ 2: Độ ẩm khơng khí giảm dần từ 92 - 90 - 85 - 80-75%

 Tiến hành gia nhiệt sơ bộ xúc xích lên men bán khơ (sau khi làm khơ, làm

chín) bằng 3 chế độ sấy như sau:

 Sấy ở 50oC/45-60 phút

 Sấy ở 55oC/30-45 phút

 Sấy ở 65oC/15-30 phút

- Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý số liê ̣u thống kê bằng phần mềm Excel 2007

2.5 . Kiểm sốt, đánh giá chất lƣợng xúc xích lên men bán khơ

2.5.1 . Kiểm soát chất lượng

nhất về nhiệt độ và độ ẩm. Thiết bị lên men được hiệu chuẩn về các thông số cài đặt và được kiểm tra hàng ngày bằng đồng hồ đo, nhiệt kế và ẩm kế[39]; [5].

2.5.2 . Đánh giá chất lượng

Chất lượng xúc xích được đánh giá qua việc đáp ứng các yêu cầu về cảm quan, đạt các chỉ tiêu kiểm nghiệm vi sinh vật và hóa lý theo TCVN 7050:2009 với sản phẩm thịt ăn ngay không qua xử lý nhiệt.

- Đánh giá yêu cầu về mặt cảm quan

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

1. Màu sắc Đặc trưng của sản phẩm

2. Mùi vị Đặc trưng của sản phẩm, khơng có mùi, vị lạ

3. Trạng thái Đặc trưng của sản phẩm

- Đánh giá yêu cầu về mặt hóa lý

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

1. Độ pH 4,5 đến 5,4

2. Phản ứng Kreiss âm tính

3. Phản ứng định tính hydro sullfua (H2S) âm tính

4. Hàm lượng amoniac, mg/100g, khơng lớn hơn 40,0

5. Hàm lượng nitrit, mg/kg, không lớn hơn 134

- Đánh giá yêu cầu về mặt vi sinh vật

Tên chỉ tiêu

Mức tối đa

Sản phẩm thịt dạng muối, xơng khói

Sản phẩm thịt lên men 1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU trên

gam sản phẩm

10 3 -

2. Coliform, CFU/g sản phẩm 50 50

3. E.coli, MPN /g sản phẩm 3 3

4. Salmonella/ 25 g sản phẩm Khơng được có Khơng được có

5. Staphylococcus aureus, MPN/g 3 3

6. Listeria monocytogenes, CFU/g Khơng được có Khơng được có

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 . Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của 3 chế độ nhiệt lên men, làm khơ và làm chín ở cùng một độ ẩm tƣơng đối khơng khí đến chất lƣợng của xúc xích lên men bán khơ

3.1.1 . Cảm quan

Ở cả ba chế độ nghiên cứu, sản phẩm xúc xích mịn, màu sắc đặc trưng, trên lát cắt ngang có mỡ phần phân bố đều, khơng bị rời, hơi mềm. Vị chua dịu, hơi mặn, có mùi thơm đặc trưng của xúc xích lên men. Đánh giá cảm quan đáp ứng được yêu cầu theo TCVN 7050: 2009

3.1.2 . Đánh giá sự biến đổi về mặt hóa lý

 pH

Giá trị pH là một tiêu chí quan trọng đánh giá q trình lên men lactic. Giá trị pH khởi đầu của 3 chế độ nhiệtLM, LK và LC khác nhau là 5,6. Kết quả cho

thấy sau 4 ngày lên men, pH giảm xuống 4,88-4,98. Ở chế độ nhiệt 2 (220C/160C),

giá trị pH tăng giảm ổn định hơn. Mức độ giảm pH nhanh trong giai đoạn này có liên quan đến sự phát triển mạnh và trao đổi chất của hệ vi khuẩn lactic bao gồm lên men carbonhydrat, sinh axit lactic. Các vi sinh vật này cũng sinh các enzym