Maesopsin Alphitonin 2-(4-hydroxybenzyl)-2,4,6-trihydroxy benzofuran-3(2H)-one (Ag-TAT2) 2-(3,4-dihydroxybenzyl)-2,4,6-trihydroxy benzofuran-3(2H)-one (Ag-TAT6) 2.2. Mục tiêu
Tổng hợp m t s các dẫn xuất nitrile của hai auronol alphitonin, maesopsin và khảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympho, hoạt tính đ c tế bào của các chất tổng hợp được.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
- Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện với bản mỏng tr ng s n -Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đ n tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thu c thử l dung dịch ceri sulfat trong acid H2SO4, sấy khơ rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
- Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tr ng s n silica gel 6 G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đ tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thu c thử l dung dịch H2SO4 %, hơ nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để x c định vùng chất; sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung mơi thích hợp.
- Sắc ký cột (CC)
Sắc ký c t được tiến hành với chất hấp phụ l Silica gel pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo YMC RP-18 (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 ((Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
- Sắc lý lỏng cao áp (HPLC)
Sắc ký lỏng cao áp Agilent technologies 1200 Series của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.2. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm
- Các phản ứng được thực hiện bằng c c phương ph p tổng hợp hữu cơ cơ bản như phương ph p khử, phương ph p oxi hóa, phương ph p ankyl hóa, phương pháp glucosyl hóa ... Ngồi ra cịn sử dụng m t s phương ph p tổng hợp hữu cơ đặc thù như: phản ứng Houben - Hoesch, phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt ...
- Phương ph p sắc ký lớp mỏng được sử dụng để giám sát tiến trình xảy ra của các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.
- Các hợp chất sau phản ứng được phân lập và tinh chế bằng c c phương pháp chiết, phương ph p sắc ký c t, phương ph p kết tinh ...
- Tất cả các hóa chất dùng trong quá trình tổng hợp được mua từ các hãng: Sigma Aldrich, Merck và sử dụng mà không cần tinh chế lại.
- Các dung môi sử dụng được cất lại hoặc l m khan theo điều kiện phản ứng.
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Phương ph p chung để x c định cấu trúc ho học của các hợp chất là sự kết hợp x c định giữa các thông s vật lý với c c phương ph p phổ hiện đại bao gồm:
- Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo bằng m y NI OLET IMP T-410 FTIR của h ng arl Zeiss Jena ( ức) tại Viện Hóa học – Viện Khoa học v ông nghệ Việt Nam
- Phổ kh i lượng (ESI-MS) được ghi tr n m y gilent 6 ion trap tại Viện Hóa học c c hợp chất thi n nhi n – Viện H n lâm Khoa học v ông nghệ Việt Nam.
- Phổ c ng hưởng từ hạt nhân (NMR) chiều v chiều sử dụng chất n i chuẩn l TMS (δ = 0ppm), dung môi CDCl3 hoặc DMSO-d6 được ghi tr n m y Bruker AM500 FT-NMR của Viện Ho học, Viện H n lâm Khoa học v ông nghệ Việt Nam ở tần s , MHz cho phổ 1
H-NMR v ở tần s ,76 MHz cho phổ 13
C-NMR ấu trúc của c c hợp chất được x c định bằng sự kết hợp c c phương pháp phổ v so s nh t i liệu
2.4. hảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympo và hoạt tính độc tế bào của các chất tổng hợp đƣợc
Khảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympo và hoạt tính đ c tế bào trên dịng tế b o thường NIH/3T3 và 4 dòng tế b o ung thư: ung thư vú M F7, ung thư phổi LU- , ung thư biểu mô KB v ung thư gan HepG được thực hiện tại phòng thử nghiệm sinh học- Viện Công nghệ sinh học - Viện hàn lâm khoa học và cơng nghệ Việt Nam.
2.4.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympo
a/ Vật liệu nghiên cứu
- Tế bào lympho tổng s thu nhận trực tiếp từ máu ngoại vi thỏ.
- Thỏ dòng Newzeland White do Trung tâm dê thỏ Ba Vì cung cấp, có kh i lượng từ , đến 2,5 kg. Thỏ được nuôi ổn định m t tuần trước khi thí nghiệm tại khu ni đ ng vật của Viện Công nghệ sinh học.
- Môi trường nuôi cấy tế bào là RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium) và các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco, Invitrogen …
b/ Phƣơng pháp nghiên cứu
ược thực hiện theo thường quy phân lập tế bào lympho từ máu ngoại vi sử
dụng Ficol paque của GE LIFE SCIENCE
https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/13 14729545976/litdoc71716700AG_20110830221438.pdf) và theo Bøyum A (1974).
Phương pháp xác dịnh khả năng kích thích miễn dịch thơng qua tăng sinh tế bào lympho
ược thực hiện theo phương ph p x c định khả năng tăng sinh tế bào nhờ MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) của Mosmann và cs (1983) và Scudiero AD và cs (1988). Về nguyên lí, tế bào lympho phân lập trực tiếp là những tế b o thường, khơng có khả năng tăng sinh v bất tử nên sẽ chết sau 1-2 ngày nuôi cấy in vitro Ngo i ra, MTT dưới t c đ ng của hệ
enzyme của ti thể trong các tế bào s ng v tăng sinh sẽ bị chuyển hóa thành dạng formazan có màu xanh tím. Do vậy, tế bào s ng càng nhiều th MTT được chuyển hóa thành formazan nhiều, giá trị O thu được càng lớn. Từ đó x c định được khả năng cảm ứng tăng sinh tế bào lympho của mẫu cần nghiên cứu.
2.4.2. Hoạt tính độc tế bào a/ Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế b o ung thư: M F7 (ung thư vú ở người); HepG (ung thư gan ở người) và SK-LU- (ung thư phổi ở người).
Dòng tế b o thường: NIH/3T3 (Nguyên bào sợi của phôi chu t là tế bào lành)
Môi trường nuôi cấy tế bào là DMEM ( ulbecco′s Modified Eagle′s
medium) và các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco, Invitrogen …
b/ Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro: ược thực hiện theo thường quy nuôi cấy của Ngân hàng tế bào Mỹ - American Type Cell Collection (ATCC - Manassas, VA 20110 USA).
Phương ph p x c định hoạt tính gây đ c tế bào tế bào in vitro: Được thực hiện theo phương ph p của Monks và cs ( 99 ) Phương ph p n y được Viện Ung thư Qu c gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử đ đ c tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng k m h m sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến h nh x c định h m lượng protein tế bào tổng s dựa vào mật đ quang học (OD – Optical ensity) đo được khi thành phần protein của tế b o được nhu m bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị O m y đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein o đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
HƢƠNG 3 - TH NGHIỆM
3.1. TỔNG HỢP H I URONOL LPHITONIN VÀ M ESOPSIN 3.1.1. Bán tổng hợp Alphitonin
lphitonin đ được tổng hợp theo phương ph p của Kiehlmann bằng phản ứng đồng phân hóa taxifolin Taxifolin đ được điều chế từ sự thủy phân astilbin m t hợp chất có h m lượng rất cao (~ 1%) trong rễ cây Thổ phục linh (Smilax
glabra Wall ex Roxb.) ở Việt Nam [5]. c bước phân lập astilbin, điều chế
taxifolin và phản ứng đồng phân hóa taxifolin được tr nh b y trong sơ đồ sau:
Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin (3)
stilbin đ được phân lập từ rễ thổ phục linh Việt nam tại phịng Cơng nghệ Hóa dược – Viện Hóa sinh biển
Chất 1 (Astilbin) là chất rắn màu trắng, tnc: 1830C – 1850C FT-IR max (cm-1 ): 3427, 3263, 2912, 1640, 1603, 1519, 1476, 1363, 1301, 1177, 1070, 977. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6,86 ( H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6′), 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), ,9 ( H, d, J = 2,0
Hz, H-6), 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,10 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-2), 4,60 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 4,28 (1H, dq, J = 6,0, 9,6 Hz, H- ′′), , 7 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- ′′), ,68 ( H, dd, J = 3,0, 9,6 Hz, H- ′′), , 6 ( H, dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H- ′′), , (1H, m, H- ′′), , ( H, d, J = 6,0 Hz, H-6′′). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,0 (C=O), 168,5 (C-7), 165,5 (C- 5), 164,1 (C-9), 147,4 (C- ′), 6, ( - ′), 9, ( - ′), , ( -6′), 6, ( - ′), 115,5 (C- ′), , ( -10), 102,1 (C- ′′), 97, ( -6), 96,2 (C-8), 83,9 (C-2), 78,5 (C-3), 73,8 (C- ′′), 72,2 (C- ′′), 7 ,8 ( - ′′), 7 , ( - ′′), 7,8 ( -6′′)
Taxifolin được điều chế từ sự thủy phân astilbin Sơ đồ phản ứng:
Hình 3.2. Phản ứng thủy phân astilbin (1) điều chế taxifolin (2)
stilbin ( , 9 g; mmol) v MeOH (8 mL) được lần lượt cho v o b nh cầu cổ có lắp sinh h n hồi lưu có phễu nhỏ giọt v đặt tr n bếp gia nhiệt có khuấy từ Hỗn hợp được khuấy cho tan hết astilbin sau đó dung dịch H l % ( , mL; mmol) được nhỏ giọt từ từ v o trong khoảng phút Sau khi nhỏ hết H l, hỗn hợp phản ứng được hồi lưu trong khoảng – giờ, kiểm tra SKLM khi astilbin bị thủy phân ho n to n th dừng phản ứng ất loại bớt dung môi rồi th m H2O (2 – 5mL) v o v chiết hỗn hợp phản ứng bằng ethyl acetate ( × mL) Kết hợp dịch chiết, rửa bằng nước đến pH = rồi l m khan v quay cất loại dung môi thu được sản phẩm thô m u v ng nhạt ( , g) Sản phẩm thô được t ch sắc ký c t nhanh tr n silica gel với hệ n-hexan/EA (1/2; v/v) thu được , 9 g Sau đó được kết tinh lại từ
hỗn hợp dung dịch MeOH/H2O ( / ; v/v) thu được , 8 g taxifolin m u v ng nhạt, hiệu suất phản ứng đạt 8 % T° n/c: -224º C. Chất 2 (taxifolin) là chất rắn màu trắng FT-IR: νKBr (cm-1): 3416, 3195, 2854, 1644, 1614, 1479, 1267, 1169. ESI-MS (m/z ): 303 [M-H]-. 1 H-NMR (CD3OD; 500 MHz): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ‘); 6,87 ( H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz; H-6‘,); 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- ‘); ,9 ( H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz; H-8); 4,93 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-2); 4,52 (1H, d, 11,5 Hz, H-3). 13 C-NMR (CD3OD; 125 MHz): δ (ppm) 198,4 (C=O); 168,7 (C-5), 165,3 (C-7), 164,5 (C-9); 147,2 (C- ‘), 6, ( - ‘), 9,9 ( - ‘), 120,9 (C-6‘); 6, ( - ‘), ,9 ( - ‘), ,9 ( -10); 97,3 (C-6); 96,3 (C-8), 85,1 (C-2); 73,7 (C-3).
lphitonin đ được bán tổng hợp từ taxifolin, phản ứng được tiến hành theo qui trình trong tài liệu [- ] theo sơ đồ hình 3.3.
Hình 3.3. Sơ đồ bán tổng hợp alphitonin (3) từ taxifolin (2)
Hỗn hợp dung dịch của taxifolin (15 mmol), nước DI(105 ml) trong m t bình kín m t cổ được làm lạnh rồi hút chân không và nạp khí nitơ v o Sau đó, b nh phản ứng được đun tr n bếp cách dầu với nhiệt đ dầu truyền nhiệt l n đến 155 o
C và thời gian phù hợp 96 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được để ngu i, lọc loại bỏ kết tủa m u v ng được x c định là quercetin. Dịch nước được chiết bằng etylaxetat khoảng 5 lần đến hết sản phẩm auronol (kiểm tra bằng
SKLM). Dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 , rồi quay cất loại dung môi. Phần cặn thô được phân tách trên c t silicagen với hệ dung môi CH2Cl2/EA(2/1) cho alphitonin (2,964g ) với hiệu suất ~ 65,01%.
Chất 3 (Alphitonin) là chất rắn màu vàng nhạt ESI-MS (negative): m/z = 303 [M-H]-. 1 H NMR (Acetone-d6, 500 MHz): δ (ppm) 9,65 (1H, brs, OH), 7,70 (1H, br s, OH), 7,66 (1H, br s, OH), 6,72 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6,6 ( H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), 6,54 (1H, d, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6′), 6, (1H, br s, OH), 5,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- 5), 5,82 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 3,05 (1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-10), 3,02 (1H, d, J = 13,5 Hz, Ha-10). 13 C NMR (Acetone-d6, 125 MHz): δ (ppm) 195,4 (C=O), 172,5 (C-8), 169,6 (C-6), 158,8 (C-4), 145,3 (C- ′), ,7 ( - ′), 6, ( - ′), ,9 ( -6′), 8, ( - ′), , ( - ′), 7, ( -2), 102,7 (C-9), 96,7 (C-5), 91,4 (C-7), 41,8 (C-10). 3.1.2. iều chế maesopsin
Maesopsin được điều chế từ sự thủy phân của glucoside maesopsin-4-O-β-D- glucopyranoside (9) là hợp chất được phân lập từ lá cây Chay Bắc b . Phản ứng thủy phân được trình bày theo sơ đồ H nh 3.4.
Auronol glucoside Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2, 9) được phân lập từ lá Chay Bắc b tại phịng Cơng nghệ Hóa dược.
ESI-MS (m/z): 449[M-H]ˉ . 1 H-NMR (500 MHz, DMSO): δ (ppm) 9,14 (OH), 7,56, 7,52 (1 × OH), 6,93/6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′,6′), 6,56/6,54 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, ′), 6,00 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 5,93 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 5,20, 5,13, 5,06, 5,01 (4 × OH), 4,97/4,90 (1H, d, J = 7,5 Hz, H- ′′), , 9/ , ( × OH), ,6 / ,6 ( H, br m, Ha-6′′), , 8 ( H, m, Hb-6′′), , 9 - 3,20 (m, H- ′′, H- ′′, H- ′′, H- ′′), 2,96 và 2,90 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-10). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO): δ (ppm) 192,8/192,4 (C=O), 171,9 (C-8), 168,5 (C-6), 156,8/156,7 (C-4), 155,9 (C- ′), , ( - ′), , / , 7( - ′), 114,7/114,6 (C- ′), ,6/ , ( -2), 102,0/101,8 (C-9), 99,5/99,3 (C- ′′), 95,8/95,3 (C-5), 91,7/91,5 (C-7), 77,2/77,1 (C- ′′), 76,8/76,7 ( - ′′), 7 , /7 ,9 ( - ′′), 69, /69, ( - ′′), 6 , /6 , ( -6′′), , ( -10).
uronol maesopsin thu được từ sự thủy phân auronol glucoside 9
Trong m t bình cầu đ được lắp sinh hàn và máy khuấy từ, gia nhiệt, hỗn hợp dung dịch của chất 9 ( , g; mmol) v MeOH ( mL) được nhỏ từ từ HCl 10% (15 mL) vào trong thời gian phút Sau đó hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong h, kiểm tra SKLM thấy glucoside đ bị thủy phân hết, cất loại dung mơi, phần dịch nước cịn lại cho vào chiết với EA (5 × 5 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, rửa với nước mu i bão hịa (2 × 5 mL), làm khan bằng Na2SO4 v được cô quay dưới chân không thấp thu được 0,43 g chất rắn. Chất rắn được phân lập bằng SKC c t trên silica gel sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexan/E ( / ) thu được 0,216 g sản phẩm maesopsin với hiệu suất 75%.
Chất 4 (Maesopsin) là chất rắn màu vàng nhạt ESI-MS (m/z): 286,9 [M-H]-. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,02 (2H, d, J = 9 Hz, H- ′, H-6′), 6, 9 ( H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H- ′), ,78 ( H, br s, H-7), 5,74 (1H, br s, H-5), 3,08 (2H, brs, CH2-10). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,8(C=O), 173,9 (C-8), 171,0 (C-6), 159,9 (C- 4), 157,2 (C- ‘), , ( - ′, - 6′), ,9 ( - ′), 115,7 (C- ′, - ′), 7, ( -2), 103,1 (C-9), 96,8 (C-5), 91,1 (C- 7), 42,1 (C-10).
3.2. TỔNG HỢP Á DẪN XUẤT NITRILE Ủ H I URONOL ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN
Các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin (4), alphitonin (3) được tổng hợp theo sơ đồ
3.2.1. Tổng hợp dẫn xuất nitrile một nhóm thế của alphitonin và maesopsin
Trong m t bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế v được nạp đầy khí N2, hỗn hợp dung dịch của chất 3 (hoặc chất 4) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,069 mL;
, mmol) trong dimethylacetamide ( mL) được cho dần NaOH (44 mg; 1,1 mmol) v o Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0o
C và 24 giờ ở nhiệt đ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được làm lạnh đến 0o v được trung hòa bằng axit H l N đến pH = 6 rồi chiết với EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4, được cô quay dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách trên c t silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất nitrile 1 nhóm thế: chất 5 (hiệu suất 37,5%) hoặc chất 6 (39,8%).
Chất 5 Alphitonin-4-O-acetonitrile ESI-MS (negative): m/z = 342 [M-H]- 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 8,65 (2H, br s, OH), 7,51 (1H, br s, OH), 6,54 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6, 9 ( H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), 6, 6 ( H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H- 6′), ,98 ( H, br s, H-5), 5,96 (1H, br s, H-7), 5,19 và 5,13 (2H, 2 × d, J = 16,0 Hz, OCH2-CN), 2,90 và 2,82 (2H, 2 × d, J = 14,0 Hz, CH2-10). 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 192,4 (C=O), 172,3 (C-8), 169,4 (C-6), 155,5 (C-4), 144,4 (C- ′), ,8 ( - ′), ,6 ( - ′), , ( -6′), 7,8 ( - ′), 116,0 (CN), 115,0 (C- ′), ,9 ( -2), 101,3 (C-9), 94,4 (C-5), 92,3 (C-7), 53,5 (O- CH2-CN), 40,7 (C-10). Chất 6: Maesopsin-4-O-acetonitrile ESI-MS (negative): m/z = 326 [M-H]-.
1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 9,12 (1H, br s, OH), 7,49 (1H, br s, OH), 6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H-6′), 6, (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H- ′), ,9 ( H, br s, H-5), 5,87 (1H, br s, H-7), 5,17 và 5,12 (2H, 2 × d, J = 16,5, O-CH2-CN), 2,93 và 2,87 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-10). 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 191,8 (C=O), 172,2 (C-8), 170,5 (C-6), 155,8 (C- ′), , (C-4), 131,2 (C- ′, -6′), , ( - ′), 6, ( N), ,6 ( - ′, C- ′), ,8 ( -2), 100,6 (C-9), 94,9 (C-5), 92,4 (C-7), 53,4 (O-CH2-CN), 40,5 (C- 10).
3.2.2. Tổng hợp dẫn xuất nitrile hai nhóm thế của lphitonin và Maesopsin
Trong m t bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế v được nạp đầy khí N2, hỗn hợp dung dịch của chất 3 (hoặc chất 4) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,138 mL; , mmol) trong dimethylacetamide ( mL) được cho dần NaOH (88 mg; 2,2 mmol) v o Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0o
C và 24 giờ ở nhiệt đ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được làm lạnh đến 0o
v được trung hòa bằng acid H l N đến pH = 6 rồi chiết với EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4, được cô quay dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách trên c t silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất nitrile 2 nhóm thế: chất 7 (hiệu suất 37%) hoặc chất 8 ( 39%).
Chất 7: Alphitonin-4,6-di-(O-acetonitrile)
ESI-MS (negative): m/z = 417 [M+2H2O-H]-, 381 [M-H]-. 1
H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,64 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6, (1H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), 6, ( H, dd, J =
2,0 , 8,0 Hz, H-6′), 6, 8 ( H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 5,00 – 5,12 (4H, m, 2 × O-CH2-CN), 3,10 và 3,06 (2H, d, J = 13,5, CH2-10). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,6 (C=O), 174,7 (C-8), 168,4 (C- 6), 157,0 (C-4), 145,6 (C- ′), , ( - ′), ,9 ( - ′), , (C-6′), 8,7 ( - ′), 116,0, (CN), 115,9 (C- ′, N), 8, ( -2), 106,1 (C-9), 95,9 (C-5), 92,7 (C-7), 55,0 (O-CH2-CN), 54,8 (O-CH2-CN), 42,2 (C-10). Chất 8: Maesopsin-4,6-di-(O-acetonitrile) ESI-MS (negative): m/z = 365 [M-H]-. 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,01 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H-6′), 6,58 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H- ′), 6, 9