Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đƣợc phân lập

Chƣơng 2 : THỰC NGHIỆM

2.5. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

2.5.4. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đƣợc phân lập

 AKRHD2.3 (β-Sitosterol)

Bột vơ định hình màu trắng.

Rf = 0,28 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 9:1, v:v). Hiện màu tím với thuốc thử vanillin/ H2SO4 đặc 1%.

IR (film) γmax (cm-1): 3402, 2933, 2866, 1653, 1462, 1377, 1051, 956.  AKRHD45.5.1 (5-Hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on)

Bột vơ định hình màu trắng.

Rf = 0,31 (TLC, silica gel, CH2Cl2-EtOAc 40:1, v:v).

1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, CH3-20), 1,25 (27H, s br, H-6a, CH2-7→CH2-19), 1,48 (1H, m, H-6b), 2,48 (1H, dd, J = 17,5 Hz, 8,5 Hz, H- 4a), 2,57 (1H, dd, J = 17,5 Hz, 3,0 Hz, H-4b), 2,72 (2H, t, J = 7,5 Hz, CH2-2), 2,83 (2H, d, J = 7,5 Hz, CH2-1), 4,01 (1H, m, H-5), 6,74 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5), 7,03 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6). 13 C-NMR (CDCl3): δ (ppm) 14,1 (C-20), 22,7 (C-19), 25,5 (C-7), 28,7 (C-1), 29,4, 29,5, 29,6, 29,67, 29,68, 29,7 (C-8→C-17), 31,9 (C-18), 36,5 (C-6), 45,3 (C-2), 49,3 (C-4), 67,7 (C-5), 115,4 (C-3, C-5), 129,4 (C-2, C-6), 132,9 (C-1), 153,9 (C- 4), 211,4 (C-3).

 AKRHD7.1 = AKRH7.3.1 (5-Hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon)

Rf = 0,48 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v:v). Hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

1

H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,85 (3H, s, OCH3-3), 3,87 (3H, s, OCH3-4), 3,89 (3H, s, OCH3-7), 6,34 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,01

(2H, d, J = 9,0 Hz, H-3, H-5), 8,07 (2H, dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, H-2, H-6), 12,65 (1H, s, OH-5).

 AKRHD7.3.2 = AKRHD7.4.2.2 = AKRHD10.(80-90).2 (5-Hydroxy-3,7,3,4- tetramethoxyflavon)

Bột vơ định hình màu vàng.

Rf = 0,36 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v:v). Hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,86 (3H, s, OCH3-3), 3,88 (3H, s, OCH3-4), 3,964 (3H, s, OCH3-7), 3,97 (3H, s, OCH3-3), 6,36 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,98 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-

2), 7,73 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 12,64 (1H, s, OH-5).

 AKRHD7.4.2.4 = AKRHD10.(80-90).3 (3,5-Dihydroxy-7,3,4- trimethoxyflavon)

Bột vơ định hình màu vàng.

Rf = 0,2 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v:v). Hiện màu vàng với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,87 (3H, s, OCH3-4), 3,872 (3H, s, OCH3-7), 3,89 (3H, s, OCH3-3), 5,71 (1H, s br, 3-OH), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,96 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 2), 7,72 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 12,63 (1H, s, OH-5).  AKRHD10.(80-90).4 (7-Hydroxy-3,5,4-trimethoxyflavon)

Rf = 0,31 (TLC, silica gel, dichlometan-EtOAc 40:1, v:v). Hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

IR (film) γmax (cm-1): 3442, 2956, 2864, 1639, 1458, 1336, 1049, 956. ESI-MS (+): m/z 328,9 [M+H]+ (C18H17O6). 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,89 (3H, s, OCH3-3), 3,92 (3H, s, OCH3-5), 3,98 (3H, s, OCH3-4), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,56 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,03 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3, H-5), 8,17 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2, H-6).  AKRHD10.(80-90).5 (3,7-Hydroxy-5,3,4-trimethoxyflavon) Bột vơ định hình màu vàng.

Rf = 0,23 (TLC, silica gel, diclometan-EtOAc 40:1, v:v). Hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

ESI-MS (–): m/z 343,9 [M–H]– (C18H15O7). 1 H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,92 (3H, s, OCH3-5), 3,96 (3H, s, OCH3-3), 3,98 (3H, s, OCH3-4), 6,36 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,55 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,0 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,40 (1H, s br, -OH), 7,80 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H- 6), 7,82 (1H, s, H-2).

 AKFH1.2.1.1 = AKFD3 (5-Hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon)

Tinh thể hình kim màu vàng.

Rf = 0,48 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 6:1, v:v). Hiện màu vàng với thuốc thử valinin/H2SO4 đặc 1%. ESI-MS (+): m/z 329,22 [M+H]+, 351,21 [M+Na]+ (C18H17O6). ESI-MS (-): m/z 327,34 [M–H]- (C18H15O6). 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,85 (3H, s, OCH3-3), 3,87 (3H, s, OCH3-4), 3,89 (3H, s, OCH3-7), 6,34 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,01 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3, H-5), 8,07 (2H, dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, H-2, H-6), 12,65 (1H, s, OH-5).  AKFH1.2.1.2 (5-Hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon)

Bột vô định hình màu vàng.

Rf = 0,32 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 6:1, v:v). Hiện màu vàng với thuốc thử valinin/H2SO4 đặc 1%.

ESI-MS (+): m/z 359,20 [M+H]+, 381,21 [M+Na]+ (C19H19O7). ESI-MS (-): m/z 357,29 [M–H] (C19H17O7). 1 H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,86 (3H, s, OCH3-3), 3,88 (3H, s, OCH3-4), 3,964 (3H, s, OCH3-7), 3,97 (3H, s, OCH3-3), 6,36 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,98 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 2), 7,73 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 12,64 (1H, s, OH-5).  AKFH1.2.1.3 (3,5-Dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon) Bột vơ định hình màu vàng.

Rf = 0,2 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 6:1, v:v). Hiện màu vàng với thuốc thử valinin/H2SO4 đặc 1%. ESI-MS (+): m/z 345,32 [M+H]+, 367,18 [M+Na]+ (C18H17O7). ESI-MS (-): m/z 343,30 [M–H] (C18H15O7). 1 H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,87 (3H, s, OCH3-4), 3,872 (3H, s, OCH3-7), 3,89 (3H, s, OCH3-3), 5,71 (1H, s br, OH-3), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,96 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 2), 7,72 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 12,63 (1H, s, OH-5).  AKFH1.3.2.1 (5-Hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon) Bột vơ định hình màu vàng.

Rf = 0,48 (TLC, silica gel, diclometan-aceton 100:1, v:v). Hiện màu vàng với thuốc thử valinin/H2SO4 đặc 1%.

ESI-MS (+): m/z 359,20 [M+H]+, 381,21 [M+Na]+ (C19H19O7). ESI-MS (-): m/z 357,29 [M–H] (C19H17O7).

1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,86 (3H, s, OCH3-3), 3,88 (3H, s, OCH3-4), 3,964 (3H, s, OCH -7), 3,97 (3H, s, OCH -3), 6,36 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45

(1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,98 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-

2), 7,73 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 12,64 (1H, s, OH-5).  AKFH1.4.1.1.1.1.3.1 (3,5-Dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon)

Bột vơ định hình màu vàng.

Rf = 0,24 (TLC, silica gel, diclometan-aceton 100:1, v:v). Hiện màu vàng với thuốc thử valinin/H2SO4 đặc 1%. ESI-MS (+): m/z 345,32 [M+H]+, 367,18 [M+Na]+ (C18H17O7). ESI-MS (-): m/z 343,30 [M–H]- (C18H15O7). 1 H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 3,87 (3H, s, OCH3-4’), 3,872 (3H, s, OCH3-7), 3,89 (3H, s, OCH3-3), 5,71 (1H, s br, OH-3), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,96 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 2), 7,72 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 12,63 (1H, s, OH-5).  AKFH1.4.2.4 (p-Hydroquinon) Bột vơ định hình màu trắng.

Rf = 0,16 (TLC, silica gel, dichlometan-EtOAc 9:1, v:v). Hiện màu vàng với thuốc thử valinin/H2SO4 đặc 1%. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 6,71 (4H, s). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,64 (4H, s). 13 C-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 116,8 (C-2, C-3, C-5, C-6), 151,3 (C- 1, C-4).

2.5.5. Phân tích định lƣợng các hợp chất flavonol AKRHD7.1, AKRHD7.3.2 và AKRHD7.4.2.4 trong thân rễ cây Thảo quả đồng bằng RP-HPLC

Phân tích định lƣợng 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavon (AKRHD7.1) và 5- hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavon (retusin) (AKRHD7.3.2) và 3,5-dihydroxy- 7,3,4-trimethoxyflavon (AKRHD7.4.2.4) đƣợc phân lập nhiều từ thân rễ đƣợc thực hiện trên hệ thống HPLC-DAD Shimadzu SIL-20AC, sử dụng cột pha o RP-18 (5 àm, 4,6 mm ì 250 mm), nhiệt độ cột 30 oC, pha động gradient acetonitrile-nƣớc cất

HPLC: 56% AcCN (0-5 phút), 100% AcCN (5,1-15,5 phút), tốc độ dịng 1 ml/phút, thể tích bơm mẫu 20 l. Các chất chuẩn định lƣợng AKRHD7.1, AKRHD7.3.2 và AKRHD7.4.2.4 (độ sạch HPLC  95%) đƣợc phân lập trong nghiên cứu này.

Hòa tan các phần chiết methanol thân rễ (34,7 mg) cây Thảo quả đồng trong 1 ml MeOH loại HPLC. Rửa giải mẫu qua cột silica gel để loại các tạp chất. Mẫu phân tích trƣớc khi đƣa lên hệ thống HPLC đƣợc lọc qua màng lọc Milipore 0,45 m và

đƣợc phân tích bằng HPLC 3 lần để lấy giá trị trung bình. Đƣờng ngoại chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên các nồng độ pha từ dung dịch gốc nồng độ 1000 ppm.

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu là thân rễ và quả cây Thảo quả đồng (Amomum

koenigii J. F. Gmelin, Zingiberaceae) đƣợc thu thập tại Krông Bông, Đắk Lắk vào tháng 7 năm 2016.

Mẫu thân rễ đƣợc làm sạch, phơi khơ trong bóng râm, rồi sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 45-50 oC trong 3 ngày, sau đó đƣợc đem xử lý thành bột.

Mẫu quả đƣợc làm sạch, sấy trong tủ sấy cho ráo nƣớc bề mặt rồi nghiền thành bột nhão.

3.2. ĐIỀU CHÉ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG

Bột khô phần thân rễ cây Thảo quả đồng đƣợc ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ phịng trong 7 ngày, sau đó lọc thu dịch lọc MeOH; quy trình này đƣợc lặp lại 3 lần. Gộp các dịch MeOH lại và cất loại kiệt MeOH dƣới áp suất giảm cho một phần chiết MeOH. Để phân tách phần chiết MeOH thành các nhóm chất theo độ phân cực, phần chiết này đƣợc chiết hai pha lỏng lần lƣợt giữa nƣớc với các dung mơi có độ phân cực tăng dần n-hexan, dichlometan và EtOAc để cho các dịch chiết hữu cơ

tƣơng ứng. Làm khô các dịch chiết hữu cơ bằng Na2SO4 rồi cất loại kiệt dung môi dƣới áp suất giảm để thu nhận các phần chiết hữu cơ. Quy trình này phân tách các hợp chất hữu cơ trong thân rễ cây Thảo quả đồng thành các phân đoạn chứa các hợp chất tan trong n-hexan (AKRH) (hiệu suất chiết 4,1% so với lƣợng nguyên liệu khô), tan trong dichlometan (AKRD) (0,23 %), tan trong ethyl acetat (AKRE) (0,2%). Dịch nƣớc còn lại sau khi chiết đƣợc cất loại nƣớc cho một phần chiết nƣớc (AKRW).

Sự phân tách này tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn các phƣơng pháp sắc ký khi phân tích định tính và định lƣợng cũng nhƣ phân lập các chất tinh khiết có trong các phần chiết.

Quả cây Thảo quả đồng đƣợc ngân trong metanol ở nhiệt độ phòng 5 lần, mỗi lần 3 ngày. Dịch chiết metanol thu đƣợc sau quá trình ngâm chiết đƣợc gộp lại và cất lại dung môi dƣới áp suất giảm cho một phần chiết metanol. Phần chiết này đƣợc hòa trong nƣớc cất và chiết lần lƣợt với các dung mơi có độ phân cực tăng dần từ n-

hexan, dichlometan, và ethyl acetat thu đƣợc các dịch chiết tƣơng ứng. Sau khi đƣợc làm khan bằng Na2SO4, các dịch này đƣợc cất loại cho các phần chiết n-hexan

(AKFH) (0,8%), dichlometan (AKFD) (0,5%), ethyl acetat (AKFE) (1,3%). Dịch nƣớc còn lại sau khi chiết đƣợc cất loại nƣớc cho một phần chiết nƣớc (AKFW).

Sơ đồ 1: Quy trình điều chế các phần chiết từ cây Thảo quả đồng

3.3. PHÂN TÁCH SẮC KÝ CÁC PHẦN CHIẾT

3.3.1. Phân tách phần chiết n-hexan và dichlometan từ thân rễ (AKRHD)

Phần chiết n-hexan và phần chiết dichlometan có sắc ký đồ TLC giống nhau

đƣợc gộp lại và phân tách bằng sắc ký cột (CC) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200

µm), rửa giải với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-aceton 19:1, 15:1, 9:1,

5:1, 3:1, 1:1 (v:v) cho 85 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có TLC Nguyên liệu

(thân rễ, quả)

1. Ngâm chiết với MeOH (7 ngày, 3 lần) 2. Lọc, tách bã nguyên liệu

3. Cất loại MeOH 4. Hòa vào nƣớc cất

Dịch nƣớc

1. Chiết bằng n-hexan 2. Cất loại kiệt n-hexan

Dịch nƣớc Phần chiết n-hexan (AKR/FH) 1. Chiết bằng CH2Cl2 2. Cất loại kiệt CH2Cl2 Phần chiết dichlometan (AKR/FD) Dịch nƣớc 1.Chiết bằng EtOAc 2. Cất loại kiệt EtOAc

Dịch nƣớc Phần chiết EtOAc

(AKR/FE)

Cất loại kiệt nƣớc

giống nhau đƣợc gộp lại và cất loại dung mơi dƣới áp suất giảm cho 11 nhóm phân đoạn từ AKRHD1 đến AKRHD11.

Các nhóm phân đoạn đƣợc rửa bằng dung mơi, tinh chế bằng cột Mini-C và kết tinh lại cho các chất AKRHD2.3 (20,1 mg) (β-sitosterol), AKRHD45.5.1 (5- hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on) (2 mg), AKHD7.1 (36,9 mg) (5-hydroxy-

3,7,4-trimethoxyflavon), AKRH7.3.2 (8,2 mg) (5-hydroxy-3,7,3,4- tetramethoxyflavon), AKRHD7.4.2.4 (25,4 mg) (3,5-dihydroxy-7,3,4- trimethoxyflavon), AKRHD10.(80-90).4 (7,3 mg) (7-hydroxy-3,5,4- trimethoxyflavon), AKRHD10.(80-90).5 (30,2 mg) (3,7-dihydroxy-5,3,4- trimethoxyflavon).

Quy trình phân tách phần chiết n-hexan và dichlometan (AKRHD) đƣợc trình bày trong Sơ đồ 2.

CC, silica gel, n-hexan-aceton 19:1, 15:1, 9:1, 5:1, 1:1 AKRHD1 0,86 g AKRHD2 0,83 g AKRHD3 0,27 g AKRHD45 0,77 g AKRHD6 3,79 g AKRHD7 1,73 g AKRHD89 3,15 g AKRHD10 2,41 g AKRHD11 5,69 g

1. Mini-C, silica gel, n-hexan- EtOAc 49:1, 29:1, 19:1, 9:1, 6:1 2. Rửa n-hexan HD2.3 20,1 mg HD2.2 = 7.1 112 mg

1. Mini-C, silica gel,

n-hexan-aceton 20:1,

15:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1 2. Rửa n-hexan

1. RP-18, MeOH-H2O 70%, 80%, 90%, 100%

2. HD10.(80-90), Mini-C, silica gel,

n-hexan-EtOAc 9:1, 6:1, 3 :1, 1 :1, 1:2

3. Rửa n-hexan

HD7.1

36,9 mg

HD7.3 HD7.4

1. Mini-C, silica gel, n- hexan-EtOAc 19:1, 12:1, 9:1, 5:1, 3:1, 1:1 2. Rửa n-hexan HD7.3.2 8,2 mg HD7.3.1 = 7.1 7,8 mg HD7.4.2.4 25,4 mg HD7.4.2.2 =7.3.2 23,2 mg

1. Mini-C, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCO2H 50:10:1, 40:10:1, 35:10:1, 20:10:1, 10:10:1

2. Mini-C, silica gel, n-hexan-EtOAc 9 :1, 6 :1, 3 :1, 1 :1

10(80-90).4 7,3 mg 10(80-90).5 30,2 mg 10.(80-90).2 = 7.3.2 86 mg 10(80-90).2 = 7.4.2.4 32 mg

Sơ đồ 2: Phân tách sắc ký phần chiết gộp n-hexan và dichlometan

AKRHD

20,19 g

AKRHD45.5.1

2 mg

1. CC, silica gel, n-hexan-

aceton 20:1, 15:1, 12:1, 9:1, 3:1 2. Mini-C, silica gel, CH2Cl2- EtOAc

3.3.2. Phân tách phần chiết n-hexan (AKFH) và dichlometan (AKFD) từ quả

Một nửa lƣợng phần chiết n-hexan (AKFH) (12,44 g) đƣợc phân tách sắc ký cột (CC). Chất hấp phụ đƣợc dùng trong sắc ký cột là silica gel Merck cỡ hạt 200- 500 µm.

Các nhóm phân đoạn đƣợc rửa bằng dung mơi, tinh chế bằng cột Mini-C và kết tinh lại cho các chất cho AKFH1.2.1.1 (5-hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon) (8 mg), AKFH1.2.1.2 (5-hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon) (6 mg), AKFH1.2.1.3 (3,5-dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon) (12 mg), AKFH1.4.2.4 (p-hydroquinon) (5 mg) = AKFH2 (5 mg).

Phần chiết AKFD đƣa lên cột Mini-C, kết tinh cho AKFD3 (5 mg). Kiểm tra sắc ký TLC cho thấy AKFD3 = AKFH1.2.1.1

Quy trình phân tách phần chiết n-hexan (AKFH) và diclometan (AKFD)

Quả cây xay nhỏ

1. Ngâm chiết với MeOH 5 lần (3 ngày/lần) 2. Lọc và cô dịch chiết dƣới áp suất giảm 3. Chiết hai pha H2O-dung môi hữu cơ 4. Cất loại kiệt dung môi dƣới áp suất giảm

AKFH 24,88 g AKFD AKFW AKFH1 4,7 g AKFH2 5 g AKFH1.1 1,33 g AKFH1.2 1,8 g AKFH1.31 50 mg AKFH1.4 1,7 g AKFH1.2.1 AKFH1.2.2 AKFH1.2.1.1 8 mg AKFH1.2.1.2 6 mg AKFH1.2.1.3 12 mg

1. CC, silica gel, H-A 6:1, 3:1, D-A 9:1, D-M 15:1 2. Rửa aceton

AKFD1 AKFD2

CC, silica gel, H-A 6:1 D-E 30:1, 9:1

AKFD1.3.1 AKFD1.3.2 AKFD1.3.3

CC, silica gel, D-E 80:1

AKFH1.3.2.1 = AKFH1.2.1.2

3 mg

AKFH1.4.1 AKFH1.4.2

1. CC, silica gel, D-E 20:1-6:1 2. CC, silica gel, D-E 50:1 3. CC, silica gel, H-A 6:1 4. CC, silica gel, D-A 150:1

AKFH1.4.1.1.1.1.3 = 1.2.1.3

3 mg

1. CC, silica gel, D-E 20:1,15:1, 9:1, 6:1 2. Rửa n-hexan

AKFH1.4.2.1

5 mg

CC, silica gel, D-E 25:1, 20:1, 15:1, 12:1 AKFH2 = 1.4.2.1 5 mg AKFD3 = 1.2.1.1 5 mg 1 Lọc MeOH 2. CC, silica gel, D-M 90:1-30:1 3. CC, silica gel, D-A 15:1-3:1 4. CC, silica gel, D-E 6:1.

3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 3.4.1. Các hợp chất đƣợc phân lập từ thân rễ

Chất AKRH2.3 (β-sitosterol) đã đƣợc phân lập từ phần chiết n-hexan và

dichlometan (AKRHD) dƣới dạng tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,28 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 9:1, v:v), vệt chất hiện màu tím với thuốc thử vanillin/

H2SO4 đặc 1%.

Chất ARHD45.5.1 (5-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on) đƣợc phân lập từ phần chiết n-hexan và dichlometan (AKRHD) dƣới dạng bột vô định hình

màu trắng, Rf = 0,31 (TLC, silica gel, CH2Cl2-EtOAc 40:1, v:v).

Chất AKRHD7.1 (5-hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon) (= AKRHD7.3.2 =

AKRHD2.2) đƣợc phân lập từ phần chiết gộp n-hexan và dichlometan (AKRHD)

dƣới dạng tinh thể hình kim màu vàng, Rf = 0,48 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc

4:1, v:v), vệt chất hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

Chất AKRHD7.3.2 (5-hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon) (=

AKRHD10.(80-90).2 = AKRHD7.4.2.2) đã đƣợc phân lập từ phần chiết gộp n-

hexan dƣới dạng bột vơ định hình màu vàng Rf = 0,36 (TLC, silica gel, n-hexan-

EtOAc 4:1, v:v), vệt chất hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

Chất AKRHD7.4.2.4 (3,5-dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon) (=

AKRHD10.(80-90).3) đã đƣợc phân lập từ phần chiết n-hexan và dichlometan

(AKRHD) dƣới dạng bột vơ định hình màu vàng Rf = 0,2 (TLC, silica gel, n-hexan- EtOAc 3:1, v:v), vệt chất hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

Chất AKRHD10.(80-90).4 (7-hydroxy-3,5,4-trimethoxyflavon) đã đƣợc phân lập từ phần chiết gộp n-hexan và dichlometan (AKRHD) dƣới dạng tinh thể

hình kim màu vàng Rf = 0,31 (TLC, silica gel, dichlometan-EtOAc 40:1, v:v), vệt chất hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

vơ định hình màu vàng Rf = 0,23 (TLC, silica gel, dichlometan-EtOAc 40:1, v:v), vệt chất hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3/EtOH 5%.

3.4.1.1. β-Sitosterol (AKRHD2.3)

Phổ IR của AKRHD2.3 cho các peak hấp thụ ở γmax (cm-1): 3402, 2933, 2866, 1653, 1462, 1377, 1051, 956.

Dựa trên so sánh dữ liệu phổ IR với tài liệu tham khảo và của mẫu chuẩn β- sitosterol, cũng nhƣ phân tích TLC với mẫu chuẩn, AKRHD2.3 đã đƣợc xác định là

β-sitosterol [43].

3.4.1.2. 5-Hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on (AKRHD45.5.1)

Phổ 1

H-NMR của hợp chất ARHD45.5.1 cho các tín hiệu cộng hƣởng của

một vòng benzen thế hai lần ở δH 6,74 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,03 (2H, d, J = 8,5 Hz), 3,89 (3H, s), 3,92 (3H, s), một nhóm oxymethin ở δH 4,01 (1H, m) và một nhóm alkyl mạch dài ở δH 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz), 1,25 (27H, s br, H-6b, CH2-7→CH2- 19), 1,48 (1H, m, H-6a). Các tín hiệu chuyển dịch trƣờng thấp hơn ở δH 2,48 (1H, dd, J = 17,5 Hz, 8,5 Hz), 2,57 (1H, dd, J = 17,5 Hz, 3,0 Hz), 2,72 (2H, t, J = 7,5

Hz), 2,83 (2H, d, J = 7,5 Hz) xác định một nhóm methylen cơ lập giữa nhóm

oxymethin và một nhóm keton carbonyl cộng hƣởng ở δC 211,4 trên phổ 13C-NMR và một mạch -CH2-CH2- giữa vịng thơm và nhóm keton carbonyl. Phổ 13C-NMR cũng cho thấy các tín hiệu cộng hƣởng của vịng thơm thế 1,4- ở δC 115,4 (C-3, C- 5), 129,4 (C-2, C-6), 132,9 (C-1), 153,9 (C-4) và nhóm oxymethin ở δC 67,7 (C- 5). Dựa trên sự phù hợp của các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR ARHD45.5.1 đã đƣợc xác định là 5-hydroxy(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on [39].

3.4.1.3. 5-Hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon (AKRHD7.1)

Phổ 1H-NMR (CDCl3) của AKRHD7.1 cho các tín hiệu cộng hƣởng của 3

nhóm methoxy ở δH 3,85 (3H, s, OCH3-3), 3,87 (3H, s, OCH3-4’), 3,89 (3H, s, OCH3-7), 2 proton tƣơng tác meta của vòng A flavonoid ở δH 6,34 (1H, d, J = 2,0

Hz, H-6), 6,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 2 cặp proton tƣơng tác para của vòng B flavonoid ở δH 7,01 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3, H-5), 8,07(2H, dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, H-2, H-6), một nhóm hydroxy phenol liên kết hydro với nhóm carbonyl ở C-4 ở δH 12,65 (1H, s, OH).

Các dữ liệu phổ 1H-NMR cho thấy AKRHD7.1 là một kaempferol trimethyl ether. Dựa trên cơ sở so sánh dữ liệu phổ 1

H-NMR với tài liệu tham khảo [24],

AKRHD7.1 đã đƣợc xác định là 5-hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon.

Phổ 1H-NMR (CDCl3) của AKRHD7.3.2 cho các tín hiệu cộng hƣởng của 4 nhóm methoxy ở δH 3,86 (3H, s, OCH3-3), 3,88 (3H, s, OCH3-4), 3,96 (3H, s, OCH3-7), 3,97 (3H, s, OCH3-3), 2 proton tƣơng tác meta của vòng A flavonoid ở δH 6,36 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) và 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 3 proton của vòng B flavonoid thế 1,3,4 ở δH 6,98 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’), 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,73 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), một nhóm hydroxy phenol tạo liên

kết hydro với nhóm cacbonyl ở C-4 δH 12,64 (1H, s, OH-5).

Các dữ liệu phổ 1H-NMR cho thấy AKRHD7.3.2 là một quercetin

tetramethyl ether. Dựa trên cơ sở so sánh dữ liệu phổ 1H-NMR với tài liệu tham khảo [28], AKRHD7.3.2 đã đƣợc xác định là 5-hydroxy-3,7,3,4- tetramethoxyflavon.

Phổ 1H-NMR (CDCl3) của AKRHD7.4.2.4 cho các tín hiệu cộng hƣởng của 3 nhóm methoxy ở δH 3,87 (3H, s, OCH3-4), 3,872 (3H, s, OCH3-7), 3,89 (3H, s, OCH3-3), 2 proton tƣơng tác meta của vòng A flavonoid ở δH 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 3 proton của vòng B flavonoid thế 1,3,4 ở

δH 6,96 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,72 (1H, dd, J =

8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 2 nhóm hydroxy phenol ở δH 5,71 (1H, s br, OH-3), 12,63 (1H, s, OH-5), nhóm hydroxy ở δH 12,63 tạo liên kết hydro với nhóm carbonyl ở C- 4.

Do đó, AKRHD7.4.2.4 có cấu trúc của một quercetin trimethyl ether. Dựa trên cơ sở so sánh dữ liệu phổ 1H-NMR với tài liệu tham khảo [28], AKRHD7.4.2.4 đã đƣợc xác định là 3,5-dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon.

3.4.1.6. 7-Hydroxy-3,5,4-trimethoxyflavon (AKRHD10.(80-90).4)

Phổ 1

H-NMR (CDCl3) của AKRHD10.(80-90).4 cho các tín hiệu cộng hƣởng