CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH
2.2.6. Phương pháp phân tích hóa lý
2.2.6.1. Xác định độ ẩm bã nấm men bằng máy đo độ ẩm bằng hồng ngoại
Cách sử dụng: Ban đầu chỉnh máy về vị trí cân bằng. Cân chính xác 50g nguyên liệu trên đĩa cân bằng quả cân 50g. Bật đèn hồng ngoại và sấy nấm men. Khi sấy, nước dần dần bay hơi làm giảm khối lượng của nguyên liệu nấm men. Khi khối lượng nguyên liệu giảm làm kim chỉ báo độ cân bằng di chuyển sang phải, cần chỉnh kim về vị trí cân bằng. Khi nào kim chỉ báo độ cân bằng dừng hẳn, có nghĩa là mẫu đã khơ hồn tồn và có thể đọc được phần độ ẩm đã mất trên thước đo. Khối lượng còn lại của nguyên liệu trên đĩa cân tương ứng với hàm lượng ẩm trong nguyên liệu:
50gram 0 – 20%
30gram 40 – 60%
20gram 60 – 80%
10gram 80 – 100%
2.2.6.2. Xác định hàm lƣợng protein thô theo phƣơng pháp Kjeldahl
Nguyên tắc:
Các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ dưới tác dụng của nhiệt độ cao và H2SO4 đậm đặc sẽ bị vơ cơ hóa. Trong q trình này các hợp chất hữu cơ sẽ bị phân giải và oxi hóa tạo thành CO2, SO2, H2O.
Các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ
CO2 + H2O + NH3 + SO2 Nitơ giải phóng ra dưới dạng amoniac NH3 sẽ tạo ngay với H2SO4 đặc thành (NH4)2SO4:
NH3 + H2SO4 đặc (NH4)2SO4
Dùng kiềm để phân giải muối này, amoniac bay ra: (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4
Thu nhận NH3 bằng dung dịch axit boric (H3BO3) ở nồng độ xác định 2,5%. Sau đó chuẩn độ bằng hệ chuẩn độ tương ứng H3BO3 – H2SO4.
* Hóa chất: H2SO4 đặc, hỗn hợp xúc tác: K2SO4/CuSO4 với tỷ lệ 3/1 hoặc
HClO4, NaOH 30%; H2SO4 0,1N, H3BO3 2,5%.
Thuốc thử hỗn hợp (Taxiro): xanh metylen 0,1%; đỏ metyl 0,1% trong etanol 96o, sau đó trộn xanh metylen với đỏ metyl theo tỷ lệ 1/2
* Dụng cụ: Ống đong 100ml, 50ml, 10ml, bình định mức 100ml, cốc 250ml, 100ml, 50ml, bình tam giác 250ml, đũa thủy tinh, lọ đựng hóa chất.
* Thiết bị: Bộ MicroKjeldhal loại 6 bình cất.
Tiến hành và tính kết quả
Giai đoạn 1: Vơ cơ hóa mẫu nghiên cứu
* Xử lý mẫu: Có thể dùng mẫu tươi hoặc mẫu khô. Trường hợp dùng mẫu tươi, trước khi công phá nên cho 1ml cồn ethylic để dịch công phá đỡ bị sủi bọt. Mẫu khô cần được sấy khô xác định độ ẩm, tán nhỏ mịn, rây qua rây (0,1mm).
Tùy theo hàm lượng protein có trong mẫu nghiên cứu nhiều hay ít mà chọn cách lấy mẫu cho thích hợp. (Ta tiến hành làm thí nghiệm với mẫu khơ).
Mẫu khô và giàu protein ta lấy mẫu 0,2g (trên cân phân tích). Cho vào bình Kjeldhal.
* Cơng phá:
Sau khi cho mẫu vào bình Kjeldhal, thêm vài giọt nước cất khơng có nitơ (nước cất 2 lần) để thấm ướt mẫu nếu là bột khô và một lượng H2SO4 đậm đặc (cứ 0,1g mẫu khô cho 1ml H2SO4 đậm đặc). Đậy kín bình, để n trong 30 phút, tránh gây ơ nhiễm mơi trường.
Đặt bình Kjeldhal nghiêng 45o
trên hệ thống đốt mẫu trong tủ hốt (ta sử dụng bếp điện có hệ thống này, khi đó ta phải đặt tấm lưới amiang lên bếp để ổn định nhiệt độ). Đun nhẹ trong 30 phút, tăng dần nhiệt độ để dung dịch sôi đều, không nên nâng nhiệt độ quá cao (100oC) làm dung dịch trong bình bắn ra ngồi. Trong q trình đun, dung dịch chuyển từ nàu đen sang màu nâu sẫm. Lấy ra để nguội. Thêm 3 – 4 giọt HClO4 nhằm xúc tác cho phản ứng vơ cơ hóa diễn ra nhanh hơn. (Nếu khơng có HClO4 mà dùng hỗn hợp K2SO4/CuSO4 theo tỷ lệ 3:1 thì có thể có khoảng 100mg ngay từ đầu). Đun tiếp dung dịch chuyển sang màu nâu cánh gián đến màu vàng nhạt, cuối cùng được dung dịch trắng trong. Kết thúc giai đoạn vơ cơ hóa.
* Pha lỗng dung dịch vơ cơ hóa: Để nguội bình Kjeldhal, sau đó chuyển sang bình định mức (100ml), dùng nước cất 2 lần tráng lại bình Kjeldhal và đưa dung dịch đến mức của bình (V), dung dịch này được sử dụng để cất amoniac.
Giai đoạn 2: Cất amoniac: Tiến hành cất amoniac trên máy MicroKjeldhal Để xác định lượng nitơ trong dung dịch mẫu có thể sử dụng hệ chuẩn H3BO3 – H2SO4
*Xác định nitơ theo hệ chuẩn H3BO3 – H2SO4:
- Chuẩn bị bình tạo hơi (1): Đổ nước cất một lần vào bình cầu đáy bằng (khoảng 2/3 thể tích của bình là đủ), đun sơi nước trong bình, trước khi cho mẫu. - Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng (2). Cho 20ml H3BO3 2,5% vào bình tam giác V = 100 – 250ml, thêm 5 giọt chỉ thị màu Taxiro, dung dịch có màu tím đỏ. (Trong mơi trường axit Taxiro có màu tím đỏ, cịn ở mơi trường kiềm có
màu xanh lá mạ). Đặt bình hứng sao cho đầu ra của ống sinh hàn ngập trong dung dịch H3BO3. Trong bình hứng, dung dịch H3BO3 tự phân ly.
H3BO3 HBO2 + H2O
- Quá trình đưa mẫu vào bình sục và cất amoniac:
+ Ta sử dụng bộ cất gồm nhiều bình (6 bình) liền nhau. Mẫu sau khi cơng phá ở bình Kjeldhal cho 1 – 2 giọt chỉ thị Taxiro, cho tiếp NaOH bão hòa vào cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh là được. Lắp trực tiếp bình Kjeldhal vào máy. Dùng lắp đậy nối liền với ống sinh hàn và bình hứng, đậy chặt vào miệng các bình Kjeldhal đang chứa mẫu. Cuối cùng lắp kín bình lại, bắt đầu bật bếp để đun.
* Chuẩn độ: Xác định lượng BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với H2SO4 0,1N khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ là được:
BO2- + H+ HBO2
Song song bình thí nghiệm, tiến hành bình đối chứng. Làm tương tự như bình thí nghiệm, chỉ khác là khơng có mẫu, cũng đốt trong 30 phút và đem cất. Chuẩn độ.
* Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ có trong nguyên liệu là:
100 42 , 1 / % c v V a ml mg Nts Trong đó:
a: Lượng H2SO4 0,1N được dùng để chuẩn độ sau khi đã trừ ở bình đối
chứng (ml).
V: Số ml dung dịch mẫu pha loãng (ml).
v: Số ml dung dịch mẫu đem cất amoniac (ml). c: Khối lượng mẫu đem phân tích (g).
1,42: Số mg nitơ tương đương với 1ml H2SO4 0,1N.
2.2.6.3. Xác định pH của bã nấm men bằng máy đo pH
Chuẩn bị mẫu cần đo. Rửa sạch bộ phận đo của máy đo pH. Chuẩn máy đo bằng nước cất. Nhúng bộ phận đo vào dung dịch mẫu. Đọc kết quả trên máy.
Sau mỗi lần đo cần rửa sạch bộ phận đo của máy bằng nước cất. Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình.