Trong đề tài, phƣơng pháp PCR khuếch đại các trình tự gắn sử dụng cặp mồi
ApF2/ApR2, thành phần và chu kỳ phản ứng nhƣ bảng 2.4.
Bảng 2.4: Thành phần PCR khuếch đại các trình tự gen Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10nM 2,5
MgCl2 25mM 1,25
Mồi xi 10pmol/µl 1
Mồi ngƣợc 10pmol/µl 1
DNA khn 10 – 100 ng/µl 5
Taq- polymease 5 unit/µl 0,3
H2O
Tổng thể tích
11,45 25
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen
10 chu kỳ
Nhiệt độ (ºC) 94 94 55 72 72 8
2.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Trong trƣờng hợp lý tƣởng, kết thúc PCR, ta thu đƣợc 1 sản phẩm duy nhất tuy nhiên thƣờng sản phẩm vẫn lẫn tạp với một lƣợng mồi, dNTPs dƣ, enzyme,
DNA polymease. Nếu không tinh sạch sản phẩm PCR, những hợp phần tạp có thể
ảnh hƣởng đến phản ứng giải trình tự sau này. Do đó, cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo các bƣớc sau (sử dụng kit của hãng QIAgen):
Bƣớc 1: Bổ sung 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều Bƣớc 2: Chuyển dịch vào cột gắn DNA và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút Bƣớc 3: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dƣới cột
Bƣớc 4: Bổ sung 500µl buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút Bƣớc 5: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dƣới cột
Bƣớc 6: Lặp lại bƣớc 4 và 5
Bƣớc 7: Ly tâm 12000 v/ph, 1 phút để làm khơ
Bƣớc 8: Bổ sung 30µl nƣớc vào cột ly tâm 12000 v/ph, 1 phút
Bƣớc 9: Chuyển dịch sau ly tấm sang ống eppendorf mới và bảo quản sản phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự
2.2.5. Phương pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc:
Điện di là hiện tƣợng dịch chuyển của các phân tử tích điện dƣới tác động của điện trƣờng. Kỹ thuật này giúp phân tách các phân tử DNA, RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý nhƣ khối lƣợng hay điện tích thực của chúng.
Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trƣờng, chúng sẽ dịch chuyển về các cực dƣơng hoặc âm tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích thực dƣơng hoặc âm, cịn các nucleic acid có điện tích âm nhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hƣớng đến cực dƣơng [11].
Các phân tử protein và nucleic acid có thể đƣợc chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) nhƣ giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc polyacrylamide) đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch
đệm để dẫn điện và tạo điện trƣờng đều, một bản gel để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. Trong đó, polyacrylamide gel đƣợc dùng để phân tách các phân tử protein và các phân tử DNA có chiều dài <1 kb, cịn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử DNA hoặc RNA có kích thƣớc từ 20 bp-20 kb.
Điện di agarose gel đƣợc xem là phƣơng pháp tối ƣu nhất dùng để phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA.
Nguyên tắc: Các phân tử nucleic acid có khối lƣợng và điện tích khác nhau đƣợc tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng của hệ điện di trong một điện trƣờng có điện thế và cƣờng độ thích hợp. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thƣớc, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trƣờng... Vị trí của DNA trong gel đƣợc xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel đƣợc nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr và có thể phát hiện dƣới ánh sáng tử ngoại.
Các yếu tố ảnh hƣởng: Kích thƣớc của phân tử, nồng độ agarose, cấu hình của DNA, thành phần base và nhiệt độ.
Nhuộm DNA bằng EtBr và chụp ảnh, quan sát. Các ứng dụng của điện di agarose gel:
- Ƣớc lƣợng kích thƣớc của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA đƣợc tạo dịng…)
- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đốn di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…)
- Phân tách DNA hệ gen đã đƣợc cắt hạn chế trƣớc khi thẩm tích Southern hoặc RNA trƣớc khi thẩm tích Northern
Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose, kích thƣớc phân tử tuyến tính với quãng đƣờng dịch chuyển của DNA trên gel agarose. Thƣờng các đoạn gen có kích thƣớc từ 300 - 10.000 bp có thể đƣợc phân tách trên gel agarose 0.8%. Nồng độ gel thƣờng phụ thuộc vào kích thƣớc sản phẩm DNA cần phân tách.
2.2.6. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
Nguyên tắc:
Chèn một đoạn DNA ngoại lai vào một phân tử DNA có kích thƣớc nhỏ (vector tách dịng) thƣờng có dạng vịng với mục đích nhân bản đoạn DNA ngoại lai với số lƣợng lớn. Vector tách dịng có các đặc điểm sau:
- Kích thƣớc tƣơng đối nhỏ so với nhiễm sắc thể của tế bàovật chủ - Có thể nhân đơi độc lập trong tế bào vật chủ
- Có vùng nhận biết enzym giới hạn
- Có thể nhận biết bằng gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu - Trình tự nucleotit đã xác định
- Phải thích hợp với tế bào vật chủ
- Có vị trí gắn phân tử DNA ngoại lai(polycloning site)
Trong đề tài sử dụng vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen) (hình 2.4) đƣợc sử dụng để gắn trực tiếp sản phẩm của PCR. Trên sản phẩm enzyme sẽ tạo một gốc adenin tự do đầu 3’ mà không phụ thuộc vào trình tự khn, trong khi đó một gốc Thymine tự do đƣợc thiết kế trên vector tách dòng pCR2.1. Điều này cho phép sản phẩm PCR có thể dễ dàng gắn vào vector khi có mặt enzyme xúc tác.
Cách tiến hành:
Sử dụng bộ kit theo vector pCR2.1 (Invitrogen) để tách dòng. Trộn các thành phần của phản ứng và ủ ở 22º trong 30 phút.
2.2.7. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli DH5α
Nguyên tắc:
Cơng đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lƣợng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến (có khả năng thấm vector tái tổ hợp). Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc đƣợc cảm ứng. Tuy nhiên, tùy theo vào loại plasmid sử dụng làm vector và tùy theo sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà ngƣời nghiên cứu sẽ chọn phƣơng pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Biến nạp là hiện tƣợng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp đƣợc thực hiện với vector chuyển gen là plasmid. Có nhiều phƣơng pháp biến nạp nhƣ hóa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phƣơng pháp bắn gen và phƣơng pháp vi tiêm. Trong đề tài nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp hóa biến nạp: dựa vào tác dụng của CaCl2 khiến thành tế bào thời kỳ sinh trƣởng trở nên xốp hơn, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng khi tiến hành sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen kháng kháng sinh có trong plasmid ngoại lai.
Cách tiến hành:
Bƣớc 1: Tế bào E. coli chủng DH5αđƣợc nuôi lắc 200v/ph, 37ºC, qua đêm
trong môi trƣờng LB lỏng.
Bƣớc 2: Pha lỗng dịch ni theo tỷ lệ 10% trong môi trƣờng lỏng, ni lắc 200v/ph, 37ºC. Sau 2h thì tiến hành kiểm tra mật độ tế bào phƣơng pháp đo OD600, đạt từ 0,6 đến 1,0 là đạt yêu cầu.
Bƣớc 3: Chuyển 1ml dịch nuôi sang ống eppendorf vô trùng, giữ trên đá 10 phút.
Bƣớc 4: Ly tâm 3000 v/ph, 4ºC trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn tế bào.
Bƣớc 5: Hòa cặn tế bào trong 300µl CaCl2 100mM, 4ºC thành dạng huyền dịch.
Bƣớc 6: Ly tâm 3000 v/ph, 4ºC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn tế bào.
Bƣớc 7: Hòa lại cặn tế bào trong 60µl CaCl2 100mM, 4ºC thành dạng huyền dịch, giữ trong đá ít nhất 1h trƣớc khi biến nạp hoặc bảo quản ở - 85ºC, trong glycerol 15-30% để sử dụng sau.
* Biến nạp:
Bƣớc 1: Các ống tế bào khả biến bảo quản ở - 85ºC đƣợc để trên đá ít nhất 30 phút.
Bƣớc 2: Trộn DNA plasmid 10-50ng với tế bào của ống tế bào khả biến sau đó để trên đá 30 phút.
Bƣớc 3: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bể ổn nhiệt, tiến hành sốc nhiệt ở 42ºC trong 60 giây.
Bƣớc 4: Chuyển nhanh eppendorf vừa sốc nhiệt trên giữ trên đá 2 phút. Bƣớc 5: Bổ sung 200µl mơi trƣờng LB lỏng ở nhiệt độ phịng, ni lắc ở 37ºC, 1h.
Bƣớc 6: Cấy trải 100µl mẫu trên mơi trƣờng LB đặc trên đĩa peptri bổ sung karamycin (50µg/ml), X-gal đến khi bề mặt đĩa khơ.
Chọn dòng tế bào tái tổ hợp:
Đây là bƣớc kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Các đĩa peptri sau khi ủ 18-20h để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ hợp. Có 3 trƣờng hợp có thể xảy ra:
Trƣờng hợp 1: Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp.
Trƣờng hợp 2: Tế bào vi khuẩn nhận plasmid nhƣng không biểu hiện gen kháng kháng sinh.
Trƣờng hợp 3: Tế bào vi khuẩn nhận đƣợc plasmid tái tổ hợp và biểu hiện gen kháng kháng sinh.
Chỉ có tế bào nhận đƣợc plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới phát triển đƣợc trên mơi trƣờng có bổ sung kháng sinh kanamycin. Chọn các khuẩn lạc màu xanh mọc riêng biệt trên đĩa thạch. Sau đó, tiếp tục cấy các các khuẩn lạc đó trong các ống mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp lắc trong máy lắc ổn nhiệt 200v/ph, 37◦C trong 10-20h để các tế bào sinh trƣởng và nhân lên số lƣợng lớn để tiến hành tách DNA plasmid.
2.2.8. Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Nguyên tắc:
Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những hợp phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của mỗi loại phân tử (nucleic acid/protein) trong hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/nƣớc). Mục đích là thu đƣợc các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Các nucleic acid cần đƣợc tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase). Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dƣới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hịa lại trong nƣớc theo nồng độ mong muốn.
Tách chiết DNA gồm các bƣớc:
- Bƣớc 2: Loại protein.
- Bƣớc 3: Thu hồi nucleic acid.
Sau khi thu hồi, làm sạch các tế bào có chứa plasmid. Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, EDTA hoặc NaOH) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra mơi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA, dsDNA biến tính thành ssDNA nằm cạnh nhau. Chất tẩy là phân tử lƣỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng. Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy khơng ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn.
Loại protein: Lắc mẫu trong dung dịch phenol:chloroform để làm biến tính protein đồng thời khơng hịa tan nucleic acid. Protein bị biến tính khơng hịa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol:chloroform.
Thu hồi nucleic acid trong pha nƣớc. Đƣa về mơi trƣờng trung tính để ssDNA đƣợc hồi tính trở lại. Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thể hịa lại trong nƣớc theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa trong ethanol hoặc isopropanol. Sau đó li tâm để thu nhận lại nucleic acid. Cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol.
Cách tiến hành:
Bƣớc 1: Hút 1ml dịch nuôi tế bào vi khuẩn trong môi trƣờng LB lỏng bổ sung Amp đã đƣợc nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 1,5ml, ly tâm 600 v/ph trong 5 phút, loại dịch nổi, thu cặn tế bào.
Bƣớc 2: Bổ sung 150µl Sol I, vortex để hịa tan tế bào. Bƣớc 3: Bổ sung 150µl Sol II, đảo nhẹ 4-6 lần.
Bƣớc 4: Bổ sung 150µl Sol III, đảo nhẹ 4-6 lần.
Bƣớc 5: Thêm 450µl dung dịch phenol:chloroform:isoamylalalcohol (25:24:1), đảo nhẹ.
Bƣớc 6: Ly tâm với tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 15 phút để dịch trong ống eppendorf phân tách thành 3 lớp.
Bƣớc 7: Hút dịch nổi ở pha trên sang ống eppendorf 1,5ml mới.
Bƣớc 8: Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1 so với mẫu, để tủa plasmid ở - 20oC trong 2h.
Bƣớc 9: Ly tâm tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 30 phút, thu cặn. Bƣớc 10: Rửa cặn bằng 500µl ethanol 70%.
Bƣớc 11: Ly tâm 12000 v/ph trong 10 phút, thu tủa.
Bƣớc 12: Làm khô DNA plasmid bằng máy Speed vac trong 3 phút. Bƣớc 13: Hịa lại cặn trong 40µl trong H2O có bổ xung RNAse. Bƣớc 14: Ủ ở 37oC trong thời gian 1h để loại RNA .
Bƣớc 15: Điện di kiểm tra kết quả tách chiết trên gel agarose 1%. Bƣớc 16: Bảo quản ở - 20o
C.
2.2.9. Phương pháp tự động giải trình tự acid nucleic
Nguyên tắc:
Phƣơng pháp này đƣợc Frederick Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977 (hình 2.5). Nguyên tắc của phƣơng pháp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP) thông thƣờng, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch đơn khoảng 20 nucleotide, bốn loại dNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ) và bổ sung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Khi mạch đơn DNA đang tổng hợp, các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở vị trí C3 và C2 sẽ đƣợc gắn thêm một ddNTP và phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi loại phản ứng đƣợc thực hiện riêng rẽ, có DNA khn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Taq DNA polymerase, dung dịch đệm và có thêm khoảng 1% một loại ddNTP. Kết quả của phản ứng là tổng hợp nên các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide và đƣợc nhận biết nhờ phƣơng pháp điện di (Hình
2.5). Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống, thu đƣợc trình tự các nucleotide của mạch đơn, có thể biết đƣợc trình tự sắp xếp các nucleotide trong gen
Cách tiến hành:
Sau khi có sản phẩm plasmid tinh sạch, chúng tơi xác định trình tự nucleic acid theo phƣơng pháp nêu trên. Phƣơng pháp này sử dụng sản phẩm của PCR cùng với ddNTP đƣợc đánh dấu huỳnh quang. Các ddNTP chỉ khác các dNTP là chúng bị mất nhóm OH ở vị trí 3, nên DNA polymerase không thể kéo dài mạch từ các phân
tử này nữa.
Bƣớc 1: Sau khi chuẩn bị thành phần phản ứng, bổ sung ddNTp, mồi, DNA khuôn, enzyme hỗn hợp phản ứng sẽ đƣợc đƣa vào máy giải trình tự tự động.
Bƣớc 2: Nhờ bộ phận phát tín hiệu huỳnh quang từ các ddNTP, trong quá trình thực hiện phản ứng trình tự của các gen sẽ đƣợc ghi lại.
Bƣớc 3: Sau khi thu đƣợc kết quả, trình tự đƣợc đăng ký trên các ngân hàng dữ liệu trình tự hoặc so sánh với các trình tự đã đƣợc cơng bố trên các ngân hàng dữ