Chất 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS THSG 11,325 3,325 1,353 11,338 1,988 1,147 11,318 3,331 1,324 11,313 3,420 1,334 RV 16,175 3,652 1,186 16,254 1,790 1,178 16,182 3,631 1,156 16,175 3,361 1,142 EM 24,226 0,337 1,308 24,250 1,458 0,937 24,209 1,095 1,299 24,202 0,220 1,261 Chất 25 µl 30 µl 40 µl 50 µl tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS THSG 11,310 3,498 1,343 11,313 3,323 1,328 11,294 2,849 1,186 11,297 2,177 0,894 RV 16,173 3,575 1,153 16,172 3,621 1,147 16,139 3,416 1,082 16,144 0,155 0,000 EM 24,212 0,118 1,245 24,215 0,113 1,265 24,204 0,119 1,271 24,190 0,161 1,282
Nhận xét thấy thể tích mẫu tiêm vào cột ảnh hƣởng rõ rệt đến kết quả phân tích. Nếu lƣợng mẫu tiêm vào cột lớn hơn 15 μl thì pic của THSG và EM sẽ không đối xứng tốt, giá trị diện tích pic của các pic này sẽ khơng chính xác và dẫn tới kết quả phân tích sai. Điều này đƣợc giải thích theo thuyết tốc độ (thuyết Van Deemter), khi lƣợng mẫu tăng thì số đĩa lý thuyết (N) của cột giảm, độ phân giải giảm theo vì RS N [10]. Kết quả trong bảng 3.10 cho thấy, với lƣợng mẫu tiêm vào cột là 10 μl thì cho kết quả tách tốt nhất. Vì vậy, chúng tơi chọn thể tích mẫu tiêm vào cột là 10 μl cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.5 Điều kiện tối ưu của quá trình tách các anthraquinon và stilben
Từ các kết quả khảo sát trên, chúng tôi xác định đƣợc điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích các thành phần THSG, RV và EM đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
+ Cột tách: Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) + Detector UV-VIS: bƣớc sóng 320 nm và 254 nm.
+ Hệ dung môi pha động: ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric. + Chế độ rửa giải: gradient, chƣơng trình dung mơi nhƣ sau:
T (phút) 0 - 5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 35 35 – 40 45 ACN (%) 10 - 30 30 30 - 70 70 70 - 100 100 100 - 10 Stop + Tốc độ dịng: 1 ml/phút
+ Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl
3.1.6 Định tính các hợp chất THSG, RV và EM trong mẫu hà thủ ô đỏ
Dựa trên điều kiện tối ƣu đã xác định đƣợc, chúng tơi tiến hành định tính các thành phần THSG, RV, EM trong mẫu hà thủ ô đỏ. Kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.5.
A B
Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính THSG, RV, EM trong mẫu hà thủ ô đỏ A: SKĐ định tính THSG và RV trong mẫu hà thủ ơ đỏ. Trong đó: A: SKĐ định tính THSG và RV trong mẫu hà thủ ơ đỏ. Trong đó:
1,2 – SKĐ các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ khác nhau (quan sát tại 320 nm) 3 – SKĐ mẫu THSG chuẩn (quan sát tại 320 nm)
4 – SKĐ mẫu RV đối chiếu (quan sát tại 320 nm)
B: SKĐ định tính EM trong mẫu dƣợc liệu hà thủ ơ đỏ. Trong đó: 1 – SKĐ mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ khác nhau (quan sát tại 254 nm) 2 – SKĐ mẫu EM chuẩn (quan sát tại 254 nm).
Với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, sắc ký đồ thu đƣợc cho các pic tách rõ ràng, pic của THSG, RV và EM sắc nhọn, đƣờng nền ổn định, tín hiệu có độ lặp lại tốt.
Do điều kiện về cơ sở vật chất, trong quá trình thực hiện đề tài này chúng tơi khơng có chất chuẩn RV mà chỉ có chất đối chiếu RV với độ tinh khiết chƣa biết chính xác (khoảng 95,0% tính theo phần trăm diện tích pic khi kiểm tra bằng phƣơng pháp HPLC). Vì vậy, chúng tôi tiếp tục xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất là THSG và EM.
3.2. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Các dung dịch dùng để dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc (mục 2.3.1). Nồng độ các dung dịch này đƣợc biểu diễn trong bảng 3.11. Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc sẽ là số liệu để dựng đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của diện tích