Các kết quả điện di trên gel SDS-PAGE và kính hiển vi điện tử cho thấy mẫu sau tinh chế vắcxin cúm của Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 đạt đƣợc độ tinh khiết cao đồng thời vẫn giữ đƣợc đặc tính của kháng nguyên cúm.
3.2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm. sản xuất vắcxin cúm.
Việc xây dựng tiêu chuẩn để đánh giá chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất là rất cần thiết, điều đó khơng những đảm bảo chất lƣợng mà cịn đảm bảo tính ổn định của sản phẩm. Trong quy trình sản xuất, việc cung cấp đƣợc những bán thành phẩm ổn định sẽ cho ra đời những liều vắcxin đạt chất lƣợng cao và an toàn cho con ngƣời. Đánh giá chất lƣợng kháng nguyên cúm trong quy trình sản xuất vắcxin đƣợc dựa trên chủ yếu là các tiêu chuẩn về hiệu giá và hàm lƣợng các kháng nguyên đặc hiệu của vắcxin cúm. Điều này giúp cho việc định liều cho thành phẩm vắcxin cúm sau này và xác định đƣợc hiệu suất của một loạt sản xuất vắcxin qua các nhiều bƣớc khác nhau.
3.2.1. Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
CCID50 là một phƣơng pháp định lƣợng cơ bản để theo dõi sự nhân lên của vi rút cúm. Mặc dù các phƣơng pháp dựa trên nuôi cấy tế bào thƣờng chậm, tiêu tốn thời gian và năng lực, nhƣng đây là một bƣớc quan trọng để tính hiệu giá vi rút cúm.
Kết quả hiệu giá vi rút cúm đề tài thu đƣợc phù hợp với nghiên cứu của Banjac và cộng sự. Các nhà nghiên cứu đã gây nhiễm vi rút cúm A/H5N1, A/H1N1, A/H3N2 và cúm B trên tế bào Vero, cho kết quả hiệu giá vi rút cúm từ 107-109 CCID50/ml [4].
Hình 3.9. Đồ thị phân tích xu hƣớng hiệu giá vi rút cúm 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1
Phân tích xu hướng hàm lượng CCID5 0
-3.00E+08 -2.00E+08 -1.00E+08 0.00E+00 1.00E+08 2.00E+08 3.00E+08 4.00E+08 5.00E+08 6.00E+08 0112 0213 0313 0413 0513 0113 0213 0313 0413 Loạt Hàm lượng CCID5 0 /ml CCID50 X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD
Hình 3.10. Đồ thị phân tích xu hƣớng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1
Từ đồ thị trên chúng tôi nhận thấy các kết quả đều nằm trong khoảng (± 2SD) chứng tỏ các loạt BTP đều ổn định vể hiệu giá vi rút. Từ đó chúng tơi phân tích dữ liệu và xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên.
3.2.2. Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
Đối với vi rút cúm, test CCID50 phải đƣợc kiểm tra cùng với test HA. HAU (đơn vị HA) tƣơng đƣơng với 2 x 106 hạt vi rút/ 50µL. Gaush và Smith thấy rằng chu kì nhân lên của vi rút cúm trong tế bào MDCK cần 8 – 10 giờ.
Phân tích xu hướng hàm lượng CCID5 0
-6.00E+08 -4.00E+08 -2.00E+08 0.00E+00 2.00E+08 4.00E+08 6.00E+08 8.00E+08 1.00E+09 0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215 Loạt Hàm lượng CCID5 0 /ml CCID50 X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD
Hình 3.11. Hình ảnh phản ứng ngƣng kết hồng cầu (HA)
(- Cột: A-chứng âm, B-chứng dƣơng có hiệu giá HA là 512, C đến H là các mẫu thử nghiệm có hiệu giá HA tƣơng ứng là 128, 128, 2048, 256, 128, 256
- Hàng: Từ 1 đến 12 là độ pha loãng tƣơng đƣơng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096)
Kết quả hiệu giá HA mà đề tài thu đƣợc phù hợp với những nghiên cứu trên thế giới. Kistner và đồng nghiệp cũng đã tiến hành nuôi cấy các chủng cúm phân typ H1, H2 và H3 khác nhau trên tế bào Vero với nồng độ gây nhiễm 0,01 CCID50/tế bào (tƣơng tự nhƣ liều gây nhiễm của chúng tôi), sau 2-3 ngày hiệu giá HA đạt 256 [23]. Kistner và đồng nghiệp cũng đã thử nghiệm nuôi cấy chủng cúm H5N1 hoang dại trên tế bào Vero, hiệu giá HA sau khi nuôi cấy đạt 512-1024 [24] và trên trứng gà có phơi cho hiệu giá HA là 1024-2048 [23]. Tuy nhiên q trình ni cấy vi rút cúm trên tế bào Vero địi hỏi phải bổ sung Trypsin vào mơi trƣờng cịn quy trình ni cấy vi rút cúm trên PMKC khơng cần thiết. Hiệu giá HA trong nƣớc nổi thu đƣợc bằng phƣơng pháp nuôi cấy trên tế bào thấp hơn trên trứng gà có phơi tuy nhiên thể tích nƣớc nổi thu đƣợc từ ni cấy tế bào thì lại lớn hơn rất nhiều so với thể tích nƣớc niệu đạo thu đƣợc từ trứng gà.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D A E F G H
Hình 3.12. Đồ thị phân tích xu hƣớng hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin
cúm A/H5N1
Hình 3.13. Đồ thị phân tích xu hƣớng hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP
vắcxin cúm A/H1N1 Phân tích hàm lượng HA -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 0112 0212 0312 0412 0512 0113 0213 0313 0413 Loạt Hàm lượng HA (HAU) HA X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD Phân tích hàm lượng HA 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215 Loạt Hàm lượng HA (HAU) HA X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD
Qua đồ thị trên, các kết quả hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hiệu giá kháng nguyên HA ổn định. Từ các phân tích trên chúng tôi đƣa ra tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 128 HAU/50µl trở lên.
3.2.3. Tiêu chuẩn hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID
Thử nghiệm khuyếch tán miễn dịch dạng tròn đơn (SRID) là một thử nghiệm để định lƣợng kháng nguyên hòa tan bằng phản ứng kết tủa miễn dịch trên môi trƣờng bán lỏng. J.M.Wood đã cải tiến phƣơng pháp của Schild 1975 để tăng tính chính xác và khả năng lặp lại.
Hình 3.14. Xác định hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID
1.Kháng nguyên chuẩn
Thử nghiệm SRID là một thử nghiệm vô cùng quan trọng trong kiểm tra vắcxin cúm. Theo quy định của TCYTTG, đối với vắcxin cúm mùa thông thƣờng thử nghiệm cơng hiệu chính là thử nghiệm SRID với yêu cầu hàm lƣợng mỗi loại kháng nguyên HA phải đạt 15 µg/liều. Thử nghiệm SRID là thử nghiệm đặc hiệu tính kháng nguyên đảm bảo chính xác hơn thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu để định lƣợng HA. Thử nghiêm SRID không bị ảnh hƣởng của sự phân giải vi rút cũng nhƣ quy trình tinh khiết kháng nguyên bề mặt trong khi sản xuất vắcxin.
Để thực hiện thử nghiệm SRID, các nhà sản xuất đều phải nghiên cứu phát triển kháng nguyên và kháng huyết thanh chuẩn. Chính vì vậy để tạo nguồn huyết thanh chuẩn đặc hiệu cho thử nghiệm SRID, chúng tôi đã tiến hành gây miễn dịch trên khỉ Maccaca mulatta (nguồn khỉ sạch đã kiểm tra vi rút ngoại lai), trên thỏ và trên dê bằng kháng nguyên HA tinh khiết qua 4 mũi tiêm, mỗi mũi cách nhau 3 tuần. Sau đó tiến hành thử nghiệm HI để xác định hiệu giá kháng thể của động vật thí nghiệm. Kết quả cho thấy sử dụng huyết thanh khỉ cho hiệu giá HI cao nhất và khi sử dụng huyết thanh khỉ ở nồng độ 1,2 µg/ml agarose trong thử nghiệm SRID có kết quả định lƣợng HA cao nhất, hệ số tƣơng quan của cả kháng nguyên chuẩn và mẫu thử đều đạt tiêu chuẩn (≥0,95), đảm bảo độ tuyến tính khi pha lỗng, độ rõ nét vòng ngƣng kết đạt yêu cầu.
Để xây dựng tiêu chuẩn hàm lƣợng kháng nguyên HA trong quy trình sản xuất vắcxin cúm, chúng tơi đã dựa trên kết quả hàm lƣợng kháng nguyên HA của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1.
Hình 3.15. Đồ thị phân tích xu hƣớng hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm
A/H5N1.
Hình 3.16. Đồ thị phân tích xu hƣớng hàm lƣợng kháng nguyên HA (SRID) trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1.
Phân tích xu hướng hàm lượng SRID
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 0112 0212 0312 0412 0512 0113 0213 0313 0413 Loạt Hàm lượng SRID SRID X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD
Phân tích xu hướng hàm lượng SRID
80.0 90.0 100.0 110.0 120.0 130.0 140.0 150.0 160.0 170.0 180.0 0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215 Loạt Hàm lượng SRID SRID X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD
Qua đồ thị trên, các kết quả đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID ổn định. Từ các phân tích trên chúng tơi đƣa ra tiêu chuẩn hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 100 µg/ml trở lên.
3.2.4. Tiêu chuẩn hàm lƣợng protein tổng số
Đối với vắcxin cúm sản xuất từ trứng gà có phơi, tiêu chuẩn của Protein tổng số không đƣợc vƣợt quá 6 lần hàm lƣợng HA [17]. Riêng về vắcxin cúm sản xuất trên tế bào, hiện nay chƣa có tiêu chuẩn về Protein tổng số vì yêu cầu giới hạn về Protein và ADN tồn dƣ của tế bào chủ không nghiêm ngặt nhƣ trứng gà có phơi chứa nhiều Albumin. Tuy nhiên hàm lƣợng Protein tổng số của các loạt vắcxin cúm sản xuất theo quy trình của chúng tơi đều khơng vƣợt q 4 lần so với hàm lƣợng kháng nguyên HA.
Hình 3.17. Đồ thị hàm lƣợng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1
Phân tích xu hướng hàm lượng Protein
0 100 200 300 400 500 600 0112 0212 0312 0412 0512 0113 0213 0313 0413 Loạt Hàm lượng Protein Protein X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD
Hình 3.18. Đồ thị hàm lƣợng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1
Qua đồ thị trên, các kết quả hàm lƣợng Protein tổng số đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hàm lƣợng Protein tổng số ổn định. Từ các phân tích trên và dựa vào tiêu chuẩn protein tổng số của vắc xin sản xuất trên trứng gà có phơi, chúng tơi đƣa ra tiêu chuẩn hàm lƣợng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml.
3.2.5. Tiêu chuẩn của điện di trên gel SDS-PAGE
Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trƣớc siêu ly tâm, khơng cịn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ cịn các băng protein của vi rút cúm.
3.2.6. Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử
Vi rút cúm sau siêu ly tâm còn nguyên vẹn với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi rút
Phân tích xu hướng hàm lượng Protein
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215 Loạt Hàm lượng Protein Protein X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD
KẾT LUẬN
1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm:
- Tìm ra các điều kiện tối ƣu cho phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) là:
+ Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC
+ Môi trƣờng nuôi cấy vi rút: môi trƣờng MEM + Thời gian nuôi cấy vi rút: 4 ngày
- Đã áp dụng đƣợc các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng kháng nguyên cúm nhƣ phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào), phƣơng pháp chuẩn độ kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu, phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID, phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số, phƣơng pháp điện di trên gel SDS-PAGE, phƣơng pháp kính hiển vi điện tử cho 9 loạt vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1.
2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lƣợng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm nhằm đảm bảo tính ổn định cũng nhƣ chất lƣợng của sản phẩm.
- Hiệu giá vi rút trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên.
- Hiệu giá kháng nguyên HA bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 128 HAU/50µl trở lên.
- Hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 100 µg/ml trở lên.
- Hàm lƣợng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml.
- Bán thành phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trƣớc siêu ly tâm, khơng cịn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm.
- Vi rút cúm sau siêu ly tâm còn nguyên vẹn với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi rút.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Thanh Thủy, Trần Quang Huy (2010). Atlas vi rút gây bệnh cho
người, Nhà xuất bản bản Khoa học tự nhiên và công nghệ.
2. Nguyễn Văn Ty (2005). Vi rút học, Nhà xuất bản Giáo dục.
3. Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng (2014).Báo cáo tổng kết giám sát cúm
mùa năm 2014, Location.
Tiếng Anh
4. Banjac, M., E. Roethl, F. Gelhart, P. Kramberger, B. L. Jarc, M. Jarc, A. Strancar, T. Muster, M. Peterka (2014). "Purification of Vero cell
derived live replication deficient influenza A and B virus by ion exchange monolith chromatography", Vaccine, 32(21): pp. 2487-92.
5. Belshe, R. B., K. M. Edwards, T. Vesikari, S. V. Black, R. E. Walker, M. Hultquist, G. Kemble, E. M. Connor, Caiv- T. Comparative Efficacy Study Group (2007). "Live attenuated versus inactivated influenza vaccine
in infants and young children", N Engl J Med, 356(7): pp. 685-96. 6. Berger, Stephen (2015). GIDEON Guide to Vaccines. 119.
7. Centers for Disease Control and Prevention, CDC (2004). "Cases of
influenza A (H5N1)--Thailand, 2004. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2004; 53:100.".
8. Centers for Disease Control and Prevention, CDC (2012). "Prevention
and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) – United States, 2012–13 influenza season.", MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 61(32): pp. 613-8.
9. Chen, H., H. Yuan, R. Gao, J. Zhang, D. Wang, Y. Xiong, G. Fan, F. Yang, X. Li, J. Zhou, S. Zou, L. Yang, T. Chen, L. Dong, H. Bo, X. Zhao,
Gong, Y. Shi, X. Ni, J. Li, J. Zhou, J. Fan, J. Wu, X. Zhou, M. Hu, J. Wan, W. Yang, D. Li, G. Wu, Z. Feng, G. F. Gao, Y. Wang, Q. Jin, M. Liu, Y. Shu (2014). "Clinical and epidemiological characteristics of a fatal
case of avian influenza A H10N8 virus infection: a descriptive study",
Lancet, 383(9918): pp. 714-21.
10. Clancy, S. (2008). "Genetics of the influenza virus", Nature Education, 1(1):
pp. 83.
11. Collin, N., X. de Radigues, H. N. Vaccine Task Force World Health Organization (2009). "Vaccine production capacity for seasonal and
pandemic (H1N1) 2009 influenza", Vaccine, 27(38): pp. 5184-6.
12. Cowling, B. J., L. Jin, E. H. Lau, Q. Liao, P. Wu, H. Jiang, T. K. Tsang, J. Zheng, V. J. Fang, Z. Chang, M. Y. Ni, Q. Zhang, D. K. Ip, J. Yu, Y. Li, L. Wang, W. Tu, L. Meng, J. T. Wu, H. Luo, Q. Li, Y. Shu, Z. Li, Z. Feng, W. Yang, Y. Wang, G. M. Leung, H. Yu (2013). "Comparative
epidemiology of human infections with avian influenza A H7N9 and H5N1 viruses in China: a population-based study of laboratory-confirmed cases",
Lancet, 382(9887): pp. 129-37.
13. Eisfeld, A. J., G. Neumann, Y. Kawaoka (2015). "At the centre: influenza
A virus ribonucleoproteins", Nat Rev Microbiol, 13(1): pp. 28-41.
14. Gilleland, H. E., Jr., L. B. Gilleland, J. Staczek, R. N. Harty, A. Garcia- Sastre, O. G. Engelhardt, P. Palese (1997). "Chimeric influenza viruses
incorporating epitopes of outer membrane protein F as a vaccine against