Bảng 2.3. Các thiết bị thí nghiệm.
Tên thiết bị Xuất xứ
Bể ổn nhiệt VS-1205CW Vision (Hàn Quốc)
Box cấy vi sinh vật Clean Bench TCV.02-1 (TTCG công nghệ) Việt Nam Box cấy vi sinh vật Laminar LB-1234
Cân phân tích BL150S Sartorius (Thụy sỹ)
Hệ thống chụp ảnh gel Dolphin-Doc CCD CAMERA 201 Wealtec (Đài Loan)
Hệ thống điện di đứng Biometra (Đức)
Máy đo pH-827 Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc ổn nhiệt ProvocellTM
Esco (Mỹ)
Máy li tâm lạnh CF16RXII Hettich (Đức)
Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R Hitachi (Nhật)
Máy nuôi lắc Certomat® HK Sartorius (Đức)
Máy PCR Thermocycler Personal Eppendorf (Đức)
Máy quang phổ UV2500 Labomed (Mỹ)
Máy siêu âm phá tế bào Misonix S-4000-010 Microson (Mỹ)
Máy Vortex OSI Rotolab (Đức)
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật)
Tủ lạnh 4C GR-N45VTV Toshiba (Nhật)
Tủ lạnh sâu -20C VCF-280 Deawoo
Tủ lạnh sâu -84C MDF-192 Sanyo (Nhật)
1.5 Phương pháp nghiên cứu
1.5.1 Các phương pháp vi sinh vật
Nuôi cấy E. coli
E. coli bảo quản ở -84C được cấy vạch lên đĩa thạch để hoạt hóa, ủ ở 37°C qua
đêm. Một khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch được nuôi trong môi trường LB lỏng, lắc 200 rpm ở 37°C qua đêm. Các chủng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường LB bổ sung 100 µg/ml ampicillin.
Ni biểu hiện
Chủng E. coli JM109(DE3) tái tổ hợp được nuôi cấy qua đêm ở 37C trong 5 ml mơi trường LB có bổ sung 100 µg/ml ampicillin. Sau đó tiếp giống 1% dịch giống sang bình 500 ml chứa 100 ml LB lỏng + 100 µg/ml ampicillin, ni lắc 37C trong 3 giờ để OD600 đạt 0,5-0,8. Bổ sung chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1 mM và tiếp tục nuôi lắc 200 rpm ở 28C để cảm ứng tế bào biểu hiện protein tái tổ hợp. Sau 6 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu bằng ly tâm 4000 rpm, trong 10 phút.
1.5.2 Các phương pháp sinh học phân tử
Nhân bản gene (PCR)
Nguyên lý: PCR là phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn
DNA theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với DNA polymerase chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dGTP, dCTP và dTTP).
Mỗi chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước: bước 1 là biến tính DNA bằng cách tăng nhiệt độ phản ứng lên 95°C có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép, bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn, bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5′-3′ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung.
Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng tỷ phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Tiến hành: Gene msk được nhân bản với cặp mồi mSKF: GGC GGA TCC CAT
ATG ATT GCT GGA CCT G và mSKR: GC CTC GAG TCA TTT GTC TTT AGG GTT ATC trong phản ứng PCR có thành phần như trong bảng 2.4 và chu trình nhiệt 95C/4′, 35x (95C /45″; 55C /45″; 72C /45″), 72C /10′. Bảng 2.4. Thành phần PCR. Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Đệm 10x 2,50 MgCl2 2,50 dNTP 2 mM 2,00
Mồi xuôi 10 pmol/µl 1,00
Mồi ngược 10 pmol/µl 1,00
Taq-polymerase 5 U/µl 0,25
DNA khn* 50-100 ng/l 1,00
H2O khử ion vô trùng 14,75
Tổng thể tích 25,00
*DNA của S. Pyogenes đã được Vũ Hồng Diệp tách chiết trong nghiên cứu trước
Phản ứng nối ghép gene
Phản ứng gắn dính bao gồm 1 µl đệm gắn dính 10x; 0,5 µl DNA plasmid; 2 µl phân đoạn chèn DNA, 0,5 µl T4 ligase, 6 µl H2O cất vơ trùng; tổng thể tích 10 µl phản ứng. Trộn đều hỗn hợp phản ứng và ủ qua đêm ở 16°C.
Biến nạp hóa học
Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 và JM109(DE3) theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phương pháp là E. coli được xử
lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các lỗ màng tế bào mở rộng làm các phân đoạn DNA đi vào dễ dàng.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được nuôi trong 3 ml LB lỏng, lắc
LB mới và lắc ở điều kiện trên trong 2-3 giờ đạt OD600nm 0,4-0,7. Dịch nuôi cấy để lạnh 30 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 5000 rpm trong 5 phút. Tế bào được ủ lần 1 với 0,1 M CaCl2 trong 45 phút, ly tâm thu tế bào. Ủ lần 2 với 0,1 M CaCl2 trong 20 phút. Tế bào đã qua xử lý được hòa trong 500 l 0,1 M CaCl2 và chia nhỏ thành các ống để biến nạp hoặc bảo quản ở tủ -84°C. Các thao tác được thực hiện ở 4°C.
Biến nạp plasmid vào E. coli: tế bào khả biến tươi hoặc từ -84oC được giải đông trong đá khoảng 30 phút. Cho 40 µl tế bào khả biến và 3 µl dung dịch sau phản ứng nối ghép gene vào một ống eppendorf mới, đảo nhẹ nhàng ủ trong đá khoảng 30 phút. Mẫu được sốc nhiệt ở 42°C trong 45 giây, sau đó đặt ngay vào trong đá 5 phút. Bổ sung 250 µl mơi trường LB lỏng và ni lắc 200 rpm ở 37°C trong 1 giờ. Cấy trải 100 µl dịch ni trên đĩa LB bổ sung 100 µg/ml ampicillin, ủ ở 37°C qua đêm.
Tách plasmid
Nguyên lý: Vi khuẩn được nuôi và nhân lên đến giai đoạn cuối của pha log. Tế
bào được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh. DNA plasmid được thu lại bằng cách kết tủa với isopropanol.
Quy trình: Ni một dịng vi khuẩn trong 3 ml mơi trường LB lỏng có bổ sung
ampicillin (100 µg/ml) ở 37°C qua đêm. Lấy 1,5 ml dịch nuôi ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, thu cặn tế bào. Bổ sung 150 µl sol I, trộn đều bằng máy lắc rung. Bổ sung tiếp 150 µl sol II, lắc đảo vài lần và để yên trong 2 phút. Bổ sung 150 µl sol III, lắc đều và giữ trong đá 5 phút để tủa protein. Thêm 450 µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), trộn đều và ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4°C. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới và bổ sung 320 µl isopropanol, trộn đều, ủ ở -20C trong 0,5-1 giờ. Ly tâm 12000 rpm trong 15 phút ở 4°C, thu tủa DNA plasmid. Rửa tủa bằng cồn 70% và ly tâm 12000 rpm trong 10 phút. Tủa DNA plasmid sau đó được làm khơ và hịa tan trong 50 µl TE. Điện di kiểm tra trên gel 0,8 % agarose.
Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn
Plasmid được cắt với NdeI và XhoI trong 2-3 giờ ở 37°C. Tổng thể tích phản
ứng 10 µl gồm 5 đơn vị enzyme, 1 µl đệm 10x, 3 µl plasmid, bổ sung nước cho đủ thể tích. Sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel 0,8% agarose.
Tinh sạch phân đoạn DNA
Phân đoạn DNA được tinh sạch bằng kit tinh sạch của hãng Promega. Mẫu DNA được chạy điện di trên gel 0,8% agarose để thu phân đoạn cần tinh sạch. Bổ sung 3 lần thể tích dung dịch liên kết (thể tích được qui đổi 1 g cho 1 ml). Ủ 55°C trong 15 phút cho gel tan hoàn toàn. Đưa dịch DNA lên cột, để 2 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13000 rpm trong 1 phút để loại dịch lỏng. Cột gắn DNA được rửa 2 lần với 500 μl dung dịch rửa và ly tâm 13000 rpm trong 1 phút. Thôi DNA bằng nước cất của hãng.
Điện di DNA
Nguyên lý: Vì nucleic acid là các đại phân tử sinh học tích điện âm nên khi chịu
tác động của điện trường không đổi chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương. Tốc độ chuyển động của chúng trong gel phụ thuộc vào kích thước. Các phân tử DNA có kích thước lớn hơn thì chạy chậm hơn các phân tử có kích thước nhỏ.
Quy trình: Chuẩn bị gel 0,8% agarose trong đệm 1x TBE được đun chảy hoàn toàn, để nguội khoảng 50°C rồi đổ vào khay điện di có cài sẵn lược. Để gel đơng khoảng 30 phút sau đó lấy lược ra cho bản gel vào bể điện di chứa đệm 1x TBE sao cho TBE ngập bản gel. 5 µl mẫu được trộn với 1 µl đệm tra mẫu 6x và đưa vào giếng. Gel được chạy điện di ở 100 V, 400 mA trong khoảng 30 phút. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào ngừng điện di. Nhuộm bản gel trong EtBr khoảng 10 phút. Kết quả được phân tích trên máy soi gel.
Giải trình tự
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn được giải trình tự theo nguyên lý của Sanger (1977) [47] dựa trên các dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp vào đầu 3'-OH, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang khơng có nhóm 3'-OH phản ứng
tổng hợp sẽ dừng lại. Nồng độ của mỗi dideoxynucleotide được xác định thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và khơng gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khn. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide [32].
Plasmid nhân dòng pJmSK, plasmid biểu hiện pEmSK được tinh sạch theo phương pháp chuẩn dùng làm khn chạy PCR để đọc trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Phần mềm DNAStar và BLAST được sử dụng phân tích, so sánh trình tự nucleotide và amino acid.
1.5.3 Các phương pháp hóa sinh
Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide
Nguyên lý: Gel polyacrylamide (SDS-PAGE) được sử dụng để điện di protein
với nồng độ 15% theo phương pháp điện di biến tính của Laemmli (1970). Nguyên lý của phương pháp là các phân tử protein trong mơi trường có SDS sẽ bị duỗi thẳng và trở nên tích điện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.
Bảng 2.5. Thành phần gel co và gel tách. Thành phần Gel tách (µl) Gel co (µl) Thành phần Gel tách (µl) Gel co (µl) H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 SDS 10% 60 20 Ammonium persulfate 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015
Quy trình: Bản gel được đổ hai lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt trên
1,5 cm, để đông 30 phút, cài lược rồi đổ tiếp lớp gel cô ở trên, để 30 phút cho gel đơng hồn tồn và ổn định. Thành phần gel như bảng 2.5.
Biến tính protein: 20 µl mẫu điện di được trộn với 5 µl đệm 5x tra mẫu protein,
spin khoảng 5 giây rồi biến tính ở 95°C trong 10 phút, sau đó lập tức cho ra 4°C.
Điện di: Bản điện di được lắp vào hệ thống điện di, đổ ngập bản điện di bằng đệm điện di protein. Mỗi giếng trên bản điện di được tra 20 µl mẫu protein đã biến tính và chạy với cường độ dịng điện 20 mA cho lớp gel cơ và 30 mA cho lớp gel tách trong vòng 45 phút. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng coomassie brilliant blue hoặc bằng bạc.
Nhuộm gel với coomassie brilliant blue: nhuộm bản gel với dung dịch nhuộm trong 1-2 giờ sau đó tẩy gel với dung dịch tẩy cho đến khi nhìn rõ các băng protein màu xanh.
Nhuộm gel bằng bạc: Cho 100 ml dung dịch 1 (50% (v/v) methanol, 5% (v/v) acetic acid, 50 µl formaldehyde), lắc trong 20 phút. Sau đó cho 100 ml dung dịch 2 (50% (v/v) methanol) trong 10 phút. Tiếp tục cho 100 ml nước cất trong 10 phút. Cho 100 ml dung dịch 3 (0,02% Na2S2O3) trong 1 phút. Sau đó cho 100 ml nước cất trong 1 phút. Cho 50 ml dung dịch 4 (0,05 g AgNO3) trong tối 20 phút. Rửa bằng nước cất trong 1 phút. Thực hiện phản ứng hiện màu bằng 100 ml dung dịch 5 (2% Na2CO3 + 50 μl formaldehyde) đến khi hiện băng. Cuối cùng, dừng phản ứng bằng dung dịch 6 (5% acid acetic).
Western blot
Nguyên lý: Western blot (cịn có cách gọi khác là blot miễn dịch) là phương
pháp phân tích sử dụng để phát hiện protein trên mẫu mô hay dịch chiết mô. Phương pháp này sử dụng điện di để phân tách protein cịn ngun vẹn hay đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide (trong điều kiện biến tính) hoặc bằng cấu trúc ba chiều của protein (khi còn nguyên vẹn hay khơng biến tính). Sau đó chuyển protein này lên màng (thường sử dụng là nitrocellulose hay PVDF), ở đó chúng được gắn (xác định) bằng kháng thể đặc hiệu với protein đích.
Quy trình: chạy điện di protein (SDS-PAGE), mỗi giếng trên bản điện di được
tra 7 µl mẫu SK tinh sạch đã biến tính, tương đương 1,25 µg SK/giếng. Sử dụng marker màu. Chuẩn bị các dung dịch: 1x đệm lai + methanol ở 4C; methanol ở
-20C, sữa gầy. Cắt màng PVDF có kích thước bằng bản gel, ngâm màng trong methanol lạnh trong 5 phút.
Ngâm bộ chuyển màng trong 1x đệm lai trong 5 phút. Bộ chuyển màng được sắp xếp theo thứ tự: (1) bản đen (-); (2) xốp; (3) giấy thấm; (4) gel; (5) PVDF; (6) giấy thấm; (7) xốp; (8) bản trắng (+). Chạy 100 V trong 2 h ở 4C.
Thu lại màng PVDF. Nhuộm màng bằng poncean trong 5 phút để kiểm tra protein đã được chuyển lên màng. Rửa màng ba lần bằng nước khử ion. Sau đó phủ màng bằng 5% sữa gầy trong 2 h hoặc qua đêm ở 4ºC. Rửa ba lần bằng 1x TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút, 50 rpm bằng máy lắc. Tiếp tục rửa tiếp ba lần bằng 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút.
Kháng thể 1 được pha loãng 1000 lần trong 25 ml 1% sữa gầy. Nhuộm màng bằng kháng thể 1 đã pha loãng, lắc trong 2-3 h. Rửa ba lần bằng 25 ml 1x TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút. Rửa tiếp ba lần bằng 25 ml 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút.
Kháng thể 2 (kháng kháng thể 1) được pha loãng tương tự kháng thể 1. Nhuộm màng bằng kháng thể 2 đã pha loãng, lắc trong 2-3 h. Rửa ba lần bằng 25 ml 1x TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút. Rửa tiếp ba lần bằng 25 ml 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút.
Thêm dung dịch hiện màu gồm ống 1: 25 ml 1x TBS + 15 µl H2O2 và ống 2: 5 ml methanol lạnh + 15 mg chất hiện màu. Trộn đều hai ống và nhuộm màng đến khi xuất hiện băng protein (khoảng 15-30 phút).
Chuẩn bị mẫu
300 ml dịch nuôi cấy được thu tại thời điểm xác định và được ly tâm 5000 rpm trong 10 phút để thu tế bào. Cặn tế bào được rửa bằng 10 ml đệm 50 mM KP, pH 7,5.
Tinh sạch protein tái tổ hợp
Nguyên lý: Protein biểu hiện dưới dạng thể vùi không tan trong đệm. Các protein
khác tan trong dịch được ly tâm để loại bỏ, cặn thu được là protein tinh sạch ở dạng thể vùi.
Qui trình: 2.5 mg cặn tế bào từ dịch ni biểu hiện mSK-nonhis được hịa trong
20 ml dung dịch đệm 50 mM KP, pH 7,5. Cặn tế bào được phá siêu âm 10 lần (mỗi lần 30 giây), ly tâm 12500 rpm trong 15 phút, thu cặn. Cặn thu được lại tiếp tục được hòa vào 20 ml đệm 50 mM KP và phá siêu âm như trên. Bước này được lặp lại khoảng 3-4 lần. Cặn cuối cùng được hòa lại vào 11 ml dung dịch 6 M guanidine để hòa tan protein thể vùi.
Hoạt hóa SK
Nguyên lý: SK biểu hiện trong E. coli JM109 ở dạng thể vùi. Để thu được protein hòa tan, SK hoạt động, các thể vùi phải được hịa tan sau đó được tái cuộn xoắn.
Quy trình: SK dạng thể vùi sau khi tinh sạch được hòa với 11 ml 6 M guanidne
để hòa tan thể vùi. Ly tâm 12500 rpm thu dịch trong (khoảng 11 ml).
5 µl SK tinh sạch đã hịa tan được pha lỗng 200 lần bằng 995 µl đệm 50 mM KP, pH 7,5. Bổ sung 0,5% Triton X-100 (+ 10% glycerol) hoặc 1% Tween 20 (+ 10% glycerol) hoặc 1,5% Tween 80 (+ 10% glycerol) và ủ 6 giờ ở 4°C rồi xác định hoạt tính.
Định lƣợng SK
Nguyên lý: hoạt độ SK được định lượng thông qua plasmin thủy giải cơ chất
N (p-tosyl) gly-pro-lys-4-nitro anilide acetate salt (AAS), và được phát hiện ở bước sóng 405 nm như đã mơ tả [26].
Tiến hành: phản ứng 1:10 μl protein trong đệm phosphate pH 7,5; 10 μl 20 mM
Tris-HCl (pH 7,5); 2 μl plasminogen người (0,025 U/μl). Hỗn hợp phản ứng 1 được ủ 30 phút ở 37°C.
Phản ứng 2: phản ứng màu được bắt đầu khi bổ sung 40 μl dung dịch 1 mM AAS. Sau 15 phút ủ ở 37°C, dừng phản ứng bằng 10 μl 0,4 N acetic acid, hỗn