2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nguyên liệu: Mẫu hải miên Haliclona varia được thu thập tại Cô Tô – Quảng Ninh vào tháng 3 năm 2014. Tên khoa học được giám định bởi PGS.TS. Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Viện Tài nguyên Môi trường biển.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất
S c k ớ ng T C
Sắc k lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng s n DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm ho c d ng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng t t trên bếp điện đến khi hiện màu.
S c k ớ ng iều chế
Sắc k lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng s n silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, ho c cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ
nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định v ng chất; sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.
S c k cột CC
Sắc k cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất hấp phụ pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) ho c YMC (30-50 m,
FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đ i ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
2.2.2. Phƣơng pháp ác đ nh cấu tr c hoá học các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật l với các phương pháp ph hiện đại bao gồm:
Phổ cộng hư ng t hạt nhân
Ph NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của
Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chu n là TMS (Tetrametyl silan).
C c k thu t hổ cộng hưởng từ hạt nh n ư c d ng ba gồ
Ph cộng hưởng t hạt nhân một chiều: 1
H-NMR, 13C-NMR và DEPT.
Ph cộng hưởng t hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC và COSY
Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD ho c CDCl3.
Phổ khối lượng
Ph khối lượng được đo trên máy Agilent 1100 của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Độ u y c c ]D
Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro
Nguyên iệu
Các hoạt chất được pha ở nồng độ gốc là 4 mg/ml trong DMSO 100%. Sau đó, được pha lỗng để có nồng độ cuối c ng trong giếng thử là 100 µg/ml trong các phép thử sàng lọc. Ở các phép thử xác định nồng độ ức chế 50% sự phát triển tế bào ung thư IC50, các mẫu được tiếp tục pha loãng 5 lần trong 4 lần liên tục để tạo loạt nồng độ bằng DMSO 10%. Các dòng tế bào ung thư bao gồm: KB, LU-1, SK-Mel2,
P388, HepG-2, LNCaP, MCF-7, SW-480 do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
Phư ng h nuôi c y tế bà in vit
Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L natri bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM natri pyruvate, ngoài ra b sung 10% huyết thanh phôi bị FBS (GIBCO). Riêng mơi trường nuôi cấy tế bào MCF-7 được b sung Insulin ở nồng độ 40 µg/L.
Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37o
C, 5% CO2.
Phư ng h c nh h ạt tính g y ộc tế bà
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chu n nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển ho c diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào t ng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
Chất thử (10 μl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ cuối c ng là 100 μg/ml; 50 μg/ml; 25 μg/ml; 12,5 μg/ml; 6,25 μg/ml.
Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho ph hợp với thí nghiệm.
Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào ph hợp 3x104
tế bào/giếng (trong 190 μl môi trường) và để chúng phát triển trong vòng t 3-4 ngày.
Một khay 96 giếng khác khơng có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190μl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở nhiệt độ 37°C. Đ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
Cuối c ng, sử dụng 10 mM unbuffered base Tris để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua ph hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có m t chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
OD(chÊt thư) - OD(ngµy 0) 100
% sống sót =
OD(đối chứng âm) - OD(ngµy 0)
Các phép thử được l p lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) được sử dụng là chất đối chứng dương. DMSO 10% luôn được sử dụng đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve.