Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.7. Điều tra vai trò của gen stuA ở nấm sợi A niger
2.2.7.1. Kiểm tra hình thái và cấu trúc cuống sinh bào tử
Kiểm tra hình thái: 10 µl dịch bào tử (106 bào tử/ml) của chủng tự nhiên A.
niger N402, chủng xóa gen stuA và chủng phục hồi được nhỏ trên đĩa môi trường
PDA và quan sát hình thái khuẩn lạc sau khi ủ đĩa 4 ngày ở 28°C.
Kiểm tra cấu trúc cuống sinh bào tử: sử dụng phương pháp nuôi trên tiêu bản (slide culture) để quan cấu trúc cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học. Chuẩn bị giấy, lam kính, lamen, giá đỡ đặt trong đĩa petri đã được khử trùng, môi trường PDA (bổ sung 12 g thạch cho 1 lit môi trường). Làm ướt lớp giấy thấm bên dưới bằng nước cất vô trùng để tạo độ ẩm cho nấm sinh trưởng. Đặt lam kính lên giá đỡ, sau đó cấy chủng tự nhiên, chủng xóa gen stuA và chủng phục hồi lên giọt thạch đã được nhỏ sẵn trên lam kính. Đậy lamen lên giọt thạch và ủ đĩa ở 25-30°C trong 2 ngày. Cấu trúc cuống sinh bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản).
2.2.7.2. Kiểm tra khả năng sinh trưởng trên các nguồn cacbon và nitơ khác nhau
Sử dụng môi trường thạch CD với 5 nguồn cacbon khác nhau (glucose, galactose, tinh bột, xylan, cellulose) và 5 nguồn nitơ khác nhau (NaNO3, NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4, CH3COONH4) với hàm lượng như nhau để kiểm tra khả năng
sinh trưởng của chủng tự nhiên, xóa gen và phục hồi gen stuA. So sánh sự sinh
trưởng giữa các chủng nấm sau 6 ngày nuôi cấy trên các môi trường này.
2.2.7.3. Kiểm tra khả năng đáp ứng stress
Nhỏ 5 µl bào tử của các chủng A. niger (chủng tự nhiên, xóa gen stuA và
phục hồi) trên đĩa môi trường PDA bổ sung H2O2 ở các nồng độ: 2 mM; 4 mM; 6 mM.
Làm tương tự với tác nhân gây stress là SDS ở các nồng độ: 0,23 mM; 0,46 mM; 0,69 mM. So sánh sự sinh trưởng giữa các chủng sau 5 ngày nuôi cấy.
2.2.7.4. Kiểm tra khả năng sinh axit hữu cơ
Nuôi lắc 1 ml bào tử (nồng độ 106
bào tử/ml) các chủng tự nhiên A. niger
N402, chủng đột biến xóa gen stuA và chủng phục hồi trong 50 ml môi trường
PDA, pH 7 với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 4 ngày, pH của dịch ni được đo bằng máy đo pH. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập.
2.2.7.5. Kiểm tra khả năng sinh enzym cellulase
Khả năng sinh enzym cellulase được kiểm tra theo phương pháp của Yang và cộng sự (2016) [116]. 10 μl bào tử nấm (nồng độ 106 bào tử/ml) của các chủng tự nhiên A. niger N402, chủng đột biến xóa gen stuA và chủng phục hồi được nuôi trên môi trường thạch sử dụng cellulose là nguồn cacbon. Sau khi ủ đĩa 7 ngày ở 28ºC, lugol được sử dụng để hiện vòng phân giải do enzym cellulase từ nấm tiết ra. Tiến hành đo đường kính vịng phân giải và so sánh giữa các chủng.
2.2.7.6. Kiểm tra khả năng lây nhiễm trên nho
Nho sạch có nguồn gốc từ Ninh Thuận được mua tại siêu thị Vinmart. Các quả có hình dạng ngun vẹn được rửa sạch bằng nước, được khử trùng bề mặt
bằng cồn 70% và được rửa lại bằng nước cất vô trùng. Các quả nho được tạo vết xước trên bề mặt quả bằng tăm vô trùng. Hút 10 μl dịch bào tử (nồng độ 106
bào tử/ml) của chủng tự nhiên N402, chủng xóa gen stuA và chủng phục hồi để cấy trực tiếp lên vết xước của quả nho. Các quả sau lây nhiễm được chuyển vào các hộp nhựa vơ trùng có bổ sung giấy thấm và nước vơ trùng để tạo độ ẩm. Các hộp được giữ ở nhiệt độ 25°C trong 9 ngày. Kết quả lây nhiễm được ghi lại bằng máy ảnh kỹ thuật số và khả năng gây hỏng quả của cả 3 chủng nêu trên được xác định theo đường kính vết hoại tử trên vỏ quả. Thí nghiệm lây nhiễm được được lặp lại 3 lần độc lập để đảm bảo độ tin cậy của kết quả thu được.