Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.2.4. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit
2.2.4.1. Giới thiệu phƣơng pháp
ELISA (Enzyme linked Immuno Sorbent Assay) hay EIA(Enzyme Immuno Assay) là một kỹ thuật sinh hoá để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng các sản phẩm sinh học.
2.2.4.2. Nguyên tắc
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – Kháng thể
và gồm các bƣớc căn bản nhƣ sau:
- Kháng nguyên – antigen(KN) chƣa biết đƣợc gắn trên một bề mặt.
- Kháng thể - antibody(KT) biết trƣớc đƣợc rửa qua bề mặt đó. Kháng thể này đƣợc gắn kết với enzyme.
- Thêm vào một cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định đƣợc.
2.2.4.3. Qui trình thí nghiệm
a. Áo đĩa bằng 100l Capture antibody pha trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỉ lệ 1/250. Ủ qua đêm ở 40 C.
b. Rửa lại 3 lần bằng dung dịch rửa với 200l/giếng.
c. Thêm 200l/giếng dung dịch Assay. Ủ 1h ở nhiệt độ phòng. d. Rửa lại 5 lần bằng dung dịch rửa.
f. Rửa lại 5 lần bằng dung dịch rửa.
g. Thêm 100l/giếng dung dịch Worrking detector gồm: Dung dịch Assay + Detection antibody + Sav - HRP. Ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng.
h. Tiến hành rửa đĩa 7 lần bằng dung dịch rửa.
i. Tiếp tục bổ sung 100l dung dịch develop vào mỗi giếng. Ủ đĩa 30 phút ở trong bóng tối.
j. Cuối cùng, thêm vào mỗi giếng 50l dung dịch stop để dừng phản ứng. Đọc bằng máy đọc ELISA Biorad, sử dụng bƣớc sóng 540nm.
2.2.4.4. Pha dung dịch chuẩn
Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 1000pg/ml và dung dịch Assay.
Sau đó tiến hành pha về các dung dịch có nồng độ thấp hơn gồm:500pg/ml; 250pg/ml;125pg/ml; 62,5pg/ml; 31,3pg/ml; 15,6pg/ml.
Dung dịch Assay đƣợc coi là có nồng độ 0pg/ml.
Sau khi đã thu đƣợc các dung dịch có nồng độ chuẩn nhƣ trên, tiến hành dựng đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn là đƣờng có dạng hàm log, cho biết mối quan hệ giữa lƣợng OD đo đƣợc và nồng độ thực tế của các cytokine.
Máy đọc ELISA sẽ cho kết quả là lƣợng OD trong dung dịch mẫu sau quá trình bắt cặp đặc hiệu KN _ KT. Kết quả này có đƣợc là do một chất hoá học đặc biệt đƣợc bổ sung trong kit, cho bƣớc sóng nhận biết đặc hiệu là 540nm. Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng tuyến tính sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của cytokine.
Các sai số trong phép đo đƣợc biểu thị thông qua hai lần xử lý số liệu:
- Sai số trong quá trình dựng đƣờng chuẩn biểu thị bằng sự sai lệch so với đƣờng tuyến tính.
- Sai số trong phép đo.
Đối với phân tích khả năng sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm bằng Zymosan trong BMDM bằng kit ELISA, ở đây là TNF , IL- 6, IL -10. BMDMs đƣợc tách từ chuột đƣợc ủ cùng với Zymosan sau một số thời gian nhất định. Thu dịch các mẫu tế bào. Sau đó các dịch này sẽ đƣợc đo nồng độ TNF , IL- 6, IL -10 bằng kit
ELISA. Các thủ tục tiến hành đo cytokine tiết ra từ các tế bào nuôi cấy sẽ đƣợc đánh giá thơng qua khả năng hấp thụ ở bƣớc sóng 540nm bằng máy đọc ELISA.
Đối với đánh giá hoạt động kích thích viêm của Dectin- 1 bằng Zymosan, BMDMs đƣợc tiền xử lý cùng với Allicin hoặc C-K trong 1h. Sau đó, các tế bào sẽ đƣợc xử lý cùng với zymosan sau 18h. Dịch các mẫu tế bào đƣợc thu lại và ly tâm sau đó tiến hành đo nồng độ các cytokine giống nhƣ trên.
Đối với đánh giá ức chế hoạt động của Dectin 1, BMDMs đƣợc tiền xử lý cùng với lamilarin (Một chất có khả năng ức chế hoạt động của Dectin -1) hoặc với Galactan (đối chứng với lamilarin) trong 1h. Sau đó, các mẫu tế bào này tiếp tục đƣợc ủ cùng với Allicin. Sau 1h, các mẫu tế bào này sẽ đƣợc xử lý cùng với Zymosan. Dịch tế bào các mẫu thu đƣợc đem ly tâm và đánh giá nồng độ cytokine giống nhƣ trên.
2.2.5. Phân tích hiệu quả ức chế con đƣờng tín hiệu MAPK p3 của Allicin khi gây viêm bằng zy osan sử ụng k thuật w st rn ot
BMDM đƣợc tiền xử lý cùng với Allicin hoặc C-K. Sau đó các tế bào sẽ đƣợc xử lý cùng với zymosan. Dịch chiết tế bào thu đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc chạy điện di trên gel 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) và chuyển lên màng PVDF. Màng này đƣợc ủ cùng với kháng thể thứ nhất phosphor-p38, p38 tổng số. Sau đó, màng sẽ đƣợc ủ cùng với kháng thể thứ hai là kháng kháng thể IgG có mang đi horseradish peroxidase. Liên kết của các kháng thể này sẽ đƣợc phát hiện bằng các chất làm tăng phát quang hóa.
2.2.6. Phân tích ức chế của Allicin trong q trình tạo phản ứng oxy hóa
BMDMs đƣợc sử lý cùng với Laminarin hoặc galactan trong 60 phút, và tích lũy với zymosan sau khi đã đƣợc ủ với không hoặc cùng với Allicin hoặc C-K trong 60 phút. Sau đó, các tế bào đƣợc ủ với DHE trong 15 phút ở 37 0C trong 5% CO2. Những tế bào này sẽ đƣợc kiểm tra bằng laser-scanning confocal microscopy (LSM 510) để xác định mật độ khác nhau của ROS trong các mẫu đã đƣợc xử lý.
2.2.7. X y ựng hình in vivo g y ệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễ tr ng trên chuột sử ụng zy osan
2.2.7.1. Gây nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở chuột bằng tiêm zymosan: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc gây nhiễm
trùng nặng và choáng khuẩn bằng cách tiêm dƣới da bụng với zymosan 2mg/kg. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày [50].
2.2.7.2. Đánh giá hiệu quả chống viêm của A icin sử ụng chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng phân tích khả năng sống xót của chuột: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc uống với các
nồng độ khác nhau của Allicin. Sau đó, sẽ tiêm zymosan đối với cả chuột đã đƣợc tiêm và không tiêm với Allicin. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày.
2.2.7.3. Đánh giá hiệu quả ức chế sản xuất cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-6) trong huyết thanh của chuột: Chuột đƣợc tiêm với các nồng độ khác nhau của
Allicin (10mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg). Sau đó, cả chuột đƣợc tiêm và không tiêm với Allicin sẽ đƣợc tiêm cùng với zymosan. Tiếp sau, lấy huyết thanh và xác định TNF-α, IL-6 bằng kít ELISA.
2.2.7.4. So sánh hiệu quả kháng viê của chất nghiên cứu và chất đối chứng C- K (Một hợp chất chiết xuất từ sâm Hàn quốc [50] trong điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng: Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng
18-22 gram) đƣợc chia thành các nhóm khác nhau và đƣợc thực hiện gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn. Chuột sẽ đƣợc uống với các nồng độ khác nhau nhƣ trên của Allicin và C-K (30mg/kg). Sau đó, sẽ đƣợc tiêm với zymosan. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày.
2.2.8. Phân tích thống kê
Đối với phân tích thống kê, các số liệu đƣợc lấy từ các kết quả độc lập, đƣợc thể hiện ý nghĩa bằng ± SD và đƣợc phân tích bằng student’s t-test cùng với điều chỉnh Bonferroni hoặc ANOVA đối với nhiều phép so sánh. Sự khác nhau sẽ đƣợc chỉ ra ý nghĩa bằng P< 0.05.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min -500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 mAU 210nm,4nm (1.00)
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá khả năng tinh sạch của Allicin 3.1. Đánh giá khả năng tinh sạch của Allicin
1 mg bột tỏi đông khô sẽ đƣợc hòa tan trong 1ml methanol. Sau đó dịch này đƣợc lọc trƣớc khi qua cột C18 đảo pha để đánh giá khả năng tinh sạch bằng phƣơng pháp HPLC. Kết quả thu đƣợc ở hình 6. Từ kết quả 6A, cho thấy hỗn hợp dịch tỏi ban đầu khi nghiền tỏi tƣơi có rất nhiều pic khác nhau. Tuy nhiên, khi dịch tỏi đã đƣợc xử lý qua phƣơng pháp sản xuất Allicin đã thu đƣợc một pic có bƣớc sóng 372nm (hình 6B). Điều này là tƣơng đƣơng với kết quả đã thu đƣợc so với Allicin chiết từ hình 6A và tinh sạch hơn.
A
B
Hình 6: Sắc ký đồ của ịch tỏi trƣớc và sau khi sản xuất A icin từ ịch tỏi.
200 300 400 500 600 700 nm 0 250 500 750 1000 1250 mAU 10.96/ 1.00 275 244 583 636 200 372 264 655 592
3.2. Quy trình sản xuất A icin từ tỏi tƣơi
Bao gồm các bƣớc sau:
Hình 7: Quy trình sản xuất A icin từ tỏi tƣơi
Sản xuất tinh thể deoxyalliin
Sản xuất Alliin
Bổ sung thêm dịch tỏi tƣơi
Dịch Allicin
Đông khô
Kiểm tra bột thu đƣợc bằng HPLC
3.3. Khả năng sống của tế ào kh ng ị ảnh hửơng ởi A icin
Để khẳng định Allicin có gây độc tố đối với tế bào BMDM hay không, BMDM đƣợc chia đều vào các giếng khác nhau trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng với mật độ 1x 105. Các BMDM này đƣợc xử lý với Allicin ở các nồng độ khác nhau nhƣ trên hình. Sau đó, BMDM đƣợc ủ cùng với 10 μl kit đếm tế bào. Kết quả đƣợc chỉ ra ở trên hình 8, tỉ lệ phần trăm của các BMDMs khơng có sự khác biệt giữa BMDMs đƣợc xử lý với các nồng độ khác nhau của Allicin sau 48 giờ. Kết quả này cho thấy Allicin khơng có khả năng gây độc với BMDM.
ĐC 10 20 30 ( μg/ml)
Hình 8: Allicin khơng gây độc đối với tế ào BMDMs
BMDMs được ni với mật độ 1×105 tế bào/ giếng. Sau 3-4 ngày, các tế bào này
được xử lý cùng với Allicin ở các nồng độ lần lượt là 10, 20, 30 μg/ml. Các tế bào sống đã được đo bằng kit đếm tế bào. Dữ liệu chỉ ra sự sai số của ba thí nghiệm độc lập.
3.4. Đánh giá khả năng zy osan kích thích tế ào BMDM sinh cytokin
Để xác định việc kích thích quá trình sinh các cytokine tiền viêm và kháng viêm của BMDM bằng zymosan, BMDM sau khi đã đƣợc nuôi trong đĩa 48 giếng với mật độ là 1x105 sẽ đƣợc ủ với zymosan (100 µg/ml) ở các thời gian khác nhau nhƣ trên hình 9. Nhƣ vậy, zymosan (100µg/ml) kích thích BMDM, sinh cytokine TNF α, IL 6, IL 12p40, IL-10 tăng dần từ mốc 0h , 4h ,8h , 18h sau đó bắt đầu giảm. Từ kết quả này, chỉ ra rằng thời gian ủ Zymosan để sinh ra Cytokine (pg/ml) nhiều nhất là sau 18 giờ.
Hình 9: Zy osan kích thích tế ào BMDM sản xuất cytokin tiền viê và kháng viêm
BMDMs từ chuột được ủ với zymosan (100µg/ml). Dịch tế bào được ủ với zymosan ở các thời gian khác nhau lần lượt là 0, 4, 8, 18, 48 giờ sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA. Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa bởi 5 thí nghiệm độc lập.
3.5. A icin ức chế quá trình sinh cytokin tiền viê trong BMDM đƣợc kích thích ởi zy osan
Vai trị của Allicin trong q trình truyền tín hiệu viêm gây ra bởi zymosan vẫn chƣa đƣợc chứng minh. Để đánh giá hiệu quả Allicin trong quá trình này, BMDM đã đƣợc ủ với các nồng độ khác nhau của Allicin trong 45 phút. Sau đó, BMDM đƣợc ủ tiếp với zymosan sau 18 giờ. Từ hình 10 cho thấy Allicin đã ức chế quá trình sản xuất cytokine tiền viêm IL-6. Từ kết quả trên cho thấy với nồng độ 20 µg/ml thì Allicin cho hiệu quả tốt nhất.
Hình 10: Al icin ức chế quá trình sinh cytokin tiền viê trong BMDM đƣợc kích thích ởi zy osan
BMDMs từ chuột được ủ cùng với Allicin (10,20,30 µg/ml), hoặc đối chứng DC(0,1%DC) trong 45phút trước khi ủ với Zymosan 100 µg/ml. Dịch sau khi tế bào được ủ với zymosan 18h sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA kit. Dịch thu được sau 18h sẽ đánh giá bằng kết quả phân tích ELISA. Các
3.6. Al icin điều hịa q trình sinh cytokin tiền viê th ng qua thụ thể Dectin-1
Thụ thể Dectin-1 tham gia chính trong q trình nhận dạng miễn dịch ban đầu của nấm thông qua liên kết glucan. Do đó, Allicin đã đƣợc điều tra xem có khả năng ức chế q trình sản xuất cytokine do zymosan kích thích. Đối với mục đích này, BMDMs đã đƣợc ủ cùng với một số nồng độ tăng dần của laminarin, một chất có khả năng ức chế q trình hoạt động của thụ thể Dectin - 1 [50], hoặc polysaccharide galactan ở các nồng độ giống nhƣ đã chỉ ra laminarin sau 60 phút. Tiếp theo, các tế bào đƣợc ủ cùng với Allicin (hình 11A), C - K (hình 11B) trƣớc khi ủ với zymosan. Tế bào ủ cùng với Laminarin xuất hiện quá trình sinh ra cytokine ngƣợc lại với tế bào không xử lý với Laminarin ở hình 11A. Các cytokine TNF-α, và IL-6 trong BMDMs đã tăng dần theo nồng độ của Laminarin. Trái lại, các tế bào đƣợc xử lý cùng với polysaccharide galactan vẫn cho kết quả giống nhƣ tế bào đƣợc xử lý với Allicin. Giống nhƣ kết quả hình 11A, các kết quả trên hình 11B cũng cho kết quả tƣơng tự (điều này đã đƣợc công bố theo [50]) . Những kết quả này gợi ý rằng thụ thể Dectin-1 có một vai trị cơ bản trong quá trình Allicin và C-K truyền đi q trình ức chế zymosan kích thích sinh ra cytokine tiền viêm trong BMDMs.
TNF-α IL-6 *** *** *** TNF-α *** *** ** 0 1200 2400 3600 4800 TNF-α 0 2000 4000 6000 8000 IL-6 Laminarin - - - 0.1 0.25 0.5- - - - - - 0.1 0.25 0.5 - - - Glactan - - - - - - 0.1 0.25 0.5 - - - - - - 0.10.250.5 Allicin - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + TNF-α IL-6 *** *** *** TNF-α *** *** ** 0 1200 2400 3600 4800 TNF-α 0 2000 4000 6000 8000 IL-6 Laminarin - - - 0.1 0.25 0.5- - - - - - 0.1 0.25 0.5 - - - Glactan - - - - - - 0.1 0.25 0.5 - - - - - - 0.10.250.5 Allicin - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + 0 2000 4000 6000 8000 ** *** IL-6 TNF-α ** *** *** Laminarin - - - 0.1 0.25 0.5- - - - - - 0.10.250.5 - - - Glactan - - - - - - 0.10.250.5 - - - - - - 0.1 0.25 0.5 C-K - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + 0 1200 2400 3600 4800 0 2000 4000 6000 8000 ** *** IL-6 TNF-α ** *** *** Laminarin - - - 0.1 0.25 0.5- - - - - - 0.10.250.5 - - - Glactan - - - - - - 0.10.250.5 - - - - - - 0.1 0.25 0.5 C-K - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + 0 1200 2400 3600 4800 0 1200 2400 3600 4800 A Laminarin - - - 0.1 0.250.5 - - - - - - 0.10.250.5 - - - Galactan - - - - - - 0.10.250.5 - - - - - - 0.10.250.5 Allicin - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + + B Laminarin - - - 0.1 0.250.5 - - - - - - 0.10.250.5 - - - Galactan - - - - - - 0.10.250.5 - - - - - - 0.10.250.5 C- K - - + + + + + + + - - + + + + + + + Zymosan - + + + + + + + + - + + + + + + + +
Hình 11: Allicin hoặc C-K điều hịa q trình đáp ứng viêm kích thích bằng