Chuẩn bị mẫu giả: để xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp cần sử dụng các mẫu có các khoảng nồng độ khác nhau của chất phân tích. Tuy nhiên, trong thực tế để có đƣợc nhiều mẫu nhƣ vật là rất khó. Vì vậy, chúng tơi tiến hành tạo mẫu giả cho quá trình đánh giá phƣơng pháp. Mẫu giả đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: từ vật liệu vải bông chuẩn (phù hợp tiêu chuẩn ISO 105 –F09) đƣợc cắt nhỏ tới kích thƣớc khoảng (0,5x0,5) cm vào các bình phản ứng, tiến hành thêm hàm lƣợng các AP, APEO ở mức
mong muốn, đậy nắp bình và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 20± 2oC và để qua đêm.
Các phép xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp sẽ đƣợc thực hiện trên mẫu các mẫu giả.
Độ lặp của thiết bị
Phƣơng pháp phân tích thể hiện tính đúng đắn trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp. Trong nghiên cứu đề tài đã khảo sát độ lặp lại trên hệ thiết bị HPLC-PAD, GC-MS sau khi chọn các điều kiện tối ƣu. Đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và thời gian lƣu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn các AP đã chọn. Mẫu đƣợc bơm vào hệ 3 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lƣu trung bình của các lần và tính đƣợc giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.
Khoảng làm việc, đường chuẩn
Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ƣu, tiến hành dựng đƣờng chuẩn cho NP, OP trên hệ thống GC-MS và HPLC-PAD đã khảo sát và thu đƣợc các phƣơng trình đƣờng chuẩn.
Độ chụm
+ Độ lặp: Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu cũng đƣợc khảo sát và đánh giá. Cùng một mẫu đƣợc cân 5 lần khối lƣợng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý đƣợc bơm lên thiết bị và tính tốn nồng độ theo đƣờng chuẩn. Tính tốn giá trị trung bình và giá trị RSD% đƣợc dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu.
+ Độ lặp lại: Để đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp xử lý mẫu, tiến hành thử nghiệm trên cùng một mẫu nhƣng tại 2 mẻ thí nghiệm khách nhau. Cùng một mẻ đƣợc
cân 5 lần khối lƣợng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện, bơm lên thiết bị và tính tốn nồng độ theo đƣờng chuẩn. Giá trị trung bình và % RSD đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp. Chuẩn Fisher cũng đƣợc sử dụng để đánh giá sự khác nhau có nghĩa của 2 mẻ thí nghiệm.
Độ đúng
Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu. Mẫu thực đƣợc thêm một lƣợng nhất định các AP, APEO chuẩn vào ở 3 mức nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng các AP sau khi xử lý nằm trong 3 khoản nồng độ của đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thống HPLC và GC-MS thu đƣợc hàm lƣợng các chất và đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu.