Chất 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS Rutin 14,087 3,128 1,355 14,138 1,978 1,152 14,237 2,233 1,124 14,313 2,419 1,334 Ginsenoside Rb1 23,098 3,644 1,281 23,154 1,791 1,176 23,192 2,651 1,265 23,175 2,874 1,153 Chất 25 µl 30 µl 40 µl 50 µl tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS tR (phút) RS AS Rutin 14,276 3,477 1,354 14,299 3,107 1,548 14,354 2,649 1,216 14,297 2,088 0,981 Ginsenoside Rb1 23,173 3,686 1,211 23,242 3,541 1,207 23,126 3,308 1,188 23,144 0,377 0,689
Nhận xét thấy thể tích mẫu tiêm vào cột ảnh hƣởng rõ rệt đến kết quả phân tích. Nếu lƣợng mẫu tiêm vào cột lớn hơn 15 μl thì pic của Rutin và Ginsenoside Rb1 sẽ không đối xứng tốt, giá trị diện tích pic của các pic này sẽ khơng chính xác và dẫn tới kết quả phân tích sai. Điều này đƣợc giải thích theo thuyết tốc độ (thuyết Van Deemter), khi lƣợng mẫu tăng thì số đĩa lý thuyết (N) của cột giảm, độ phân giải giảm theo vì RS N [11]. Kết quả trong bảng 3.10 cho thấy, với lƣợng mẫu tiêm vào cột là 10 μl thì cho kết quả tách tốt nhất. Vì vậy, chúng tơi chọn thể tích mẫu tiêm vào cột là 10 μl cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.4. Điều kiện tối ưu của quá trình tách hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1
Từ các kết quả khảo sát trên, chúng tôi xác định đƣợc điều kiện tối ƣu cho q trình phân tích các thành phần Rutin và Ginsenoside Rb1 đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
+ Cột tách: Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) + Detector UV-VIS: bƣớc sóng 203 nm và 257 nm.
+ Hệ dung môi pha động: ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric. + Chế độ rửa giải: gradient, chƣơng trình dung mơi nhƣ sau:
T (phút) 0 10 20 25 30 40 45
ACN (%) 10 15 30 30 100 100 Stop
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút
+ Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl
3.1.5. Định tính các hợp chất Ginsenoside Rb1 và Rutin trong mẫu Giảo cổ lam
Dựa trên điều kiện tối ƣu đã xác định đƣợc, chúng tôi tiến hành định tính các thành phần Rutin và Ginsenoside Rb1 trong mẫu Giảo cổ lam. Kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.5.
Hình 3.5. Sắc ký đồ định tính Rutin và Ginsenoside Rb1 trong mẫu Giảo cổ
lam Vĩnh Phúc
Với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, sắc ký đồ thu đƣợc cho các pic tách rõ ràng, pic của Rutin và Ginsenoside Rb1 sắc nhọn, đƣờng nền ổn định, tín hiệu có độ lặp lại tốt. Do đó, chúng tơi tiếp tục xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1
3.2. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Các dung dịch dùng để dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc (mục 2.3.1). Nồng độ các dung dịch này đƣợc biểu diễn trong bảng 3.8. Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc sẽ là số liệu để dựng đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.