Cho thấy phạm vi hoạt động rộng được thực hiện bởi các tiểu đơn vị và các vùng trong enzyme tổng hợp axit béo và polyketide. Các mũi tên nét liền thể hiện con đường tổng hợp axit béo. Các mũi tên đứt đoạn cho thấy con đường tiềm năng của các enzyme tổng hợp polyketide và bổ sung với các mũi tên nét liền. A-D thể hiện các phiên bản thay thế của chu trình khử được dẫn dắt lần lượt bởi các nhóm
chức keto, hydroxyl, enoyl hoặc methylene như β-cacbon đặc trung trong lắp ráp các polyketide khử hóa [24].
Các đường nét đứt trong hình 1.6 chỉra các con đường thay thế trong hệ thống enzyme PKS và các mũi tên liền đại diện cho hệ thống enzyme FAS. Sự khử ở các giai đoạn khác nhau trong chu trình tạo ra các polyketide. Hình 1.6 A - D sự khử ketoacyl-ACP, hydroxyacyl-ACP, enoyl-ACP acyl-ACP tạo thành keto, hydroxyl, enoyl và methylene có chức năng trong phân tử polyketide dạng khử. Con đường PKS cũng khác nhau trong cách tổng hợp DHA từ hệ thống khử bão hòa/kéo dài chuỗi ởđặc điểm kỵ khí. Mặc dù, con đường này đạt được chức năng khi có sự hiện diện của oxy nhưng oxy phân tử không cần thiết ở bất kỳ điểm nào trong con đường. Do đó, liên kết đơi có trong một chuỗi acyl khơng cần phải giảm độ bão hịa hiếu khí.
Cơ chế chính xác dưới sự tổng hợp sinh DHA theo con đường PKS đã được
xác định [33]. Tuy nhiên, các tính năng chính có thể bao gồm các bước ngưng kết
và chuyển vị. Enzyme ketosynthase đóng vau trị quan trọng xúc tác cho sự ngưng kết của một loạt các chất bao gồm axit béo khơng bão hịa. Như vậy, sựngưng kết chọn lọc enoyl-ACP với malonyl-ACP sẽ tạo ra một axit béo với nhiều liên kết đôi [40].
Trong một nghiên cứu của Ren (2009), ảnh hưởng khi bổ sung axit acetic vào môi trường nuôi cấy Schizochytrium sp. HX-308 đã được quan sát. Giả thuyết cho rằng bằng cách thêm acetate vào môi trường nuôi cấy trong giai đoạn sinh trưởng tích lũy Lipit, nguồn cung acetyl-CoA sẽtăng lên và kết quả là dẫn đến sự tổng hợp axit béo tăng và tỷ lệ phần trăm của DHA trong những axit béo cũng tăng. Sinh vật nhân chuẩn có chứa các enzyme acetyl-CoA synthase có thể trực tiếp chuyển đổi acetate thành acetyl-CoA. Kết quả của nghiên cứu này ủng hộ giả thuyết ban đầu: bổ sung acetate sẽ là làm tăng cả axit béo tổng số và tỷ lệ DHA. Tuy nhiên, các tác giả của nghiên cứu này cho rằng việc bổ sung acetate tạo hiện tượng tăng như trên chỉ theo con đường FAS. Song, có khả năng một phần của sự gia tăng có thể là do
Metz và cộng sự(2001) đã sử dụng acetate gắn nhãn C14để chứng minh sự tồn tại của một con đường PKS trong Schizochytrium spp, và đã ghi nhận việc kết hợp acetate có gắn nhãn vào các phân tử PUFA chuỗi dài. Mặc dù, theo kết luận của Ren và cộng sự(2009) dường như việc sử axit axetic cho vào môi trường nuôi cấy làm tăng tổng số axit béo và DHA, nhưng lý do cho sự gia tăng DHA này có thể khơng phải là do một con đường thích hợp đã được đề xuất. Tuy nhiên, nghiên cứu này cũng cho thấy bằng cách hiểu được cơ chế sản xuất DHA ở thraustochytrid, con đường sinh tổng hợp có thể được tăng cường thơng qua việc bổ sung các tiền chất hợp lý sẽ dẫn đến năng suất sản phẩm cao hơn [32, 47].
1.3. Các yếu tốảnh hưởng đến sinh trưởng và sản xuất PUFA
Để điều tra tiềm năng công nghệ sinh học trong việc sử dụng thraustochytrid để sản xuất PUFA, tác động của các điều kiện nuôi cấy khác nhau lên năng suất DHA đã được nghiên cứu. Năng suất DHA tạo thành phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy, pha sinh trưởng, các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ cũng như nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, phospho, natri, các yếu tố vết, nhân tố sinh trưởng… Các dạng PUFA của một sốnhóm thraustochytrid đã được điều tra và so sánh gần đây [30, 57]. Hệ thống chuyển gen đối với thraustochytrid cũng được phát triển với mục tiêu tạo ra các đột biến ưu thế cho sản xuất PUFAs [49]. Do đó, thraustochytrid được xem như là nguồn hứa hẹn cho sản xuất PUFA.
1.3.1. Dinh dưỡng 1.3.1.1. Nguồn Cacbon 1.3.1.1. Nguồn Cacbon
Thraustochytrid có khả năng sử dụng nhiều nguồn cacbon cho sinh trưởng và sản xuất DHA như glucose, fructose, lactose, tinh bột và cả glycerol,… tuy nhiên,
glucose thường được ưu tiên nhất [2, 17, 23, 44]. Trong khi đó, di- và
polysaccharides ít khi được sử dụng, song cũng có một số ít chủng có thể sử dụng maltose và tinh bột hiệu quả [45]. Các chủng thường sinh trưởng tốt nhất trong môi trường bổ sung glucose với nồng độđặc trưng. Ví dụnhư Thraustochytrid sp. SB04
cho sinh khối lớn nhất (> 1.0 g/100 ml) sau 3 ngày nuôi cấy trong môi trường 3% glucose. Schizochytrium spp. sau 3 ngày nuôi cấy trong môi trường 5% glucose cho
0.8 g/ 100ml sinh khối [2]. Chủng Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381 (trước đây là Schizochytrium limacinum SR21) khi sử dụng glucose, fructose và glycerol đều sinh trưởng tốt và tạo lượng DHA cao (30% axit tổng số), và cho thấy có thể sản xuất hơn 4 g DHA/l khi sử dụng glucose 9% hoặc 12% glycerol làm nguồn cacbon [57].
1.3.1.2. Nguồn Nitơ
Các chủng thraustochytrid có thể sử dụng nitơ vô cơ (amonni và nitrate)
nhưng nitơ hữu cơ vẫn cho hiệu quả sinh trưởng tốt hơn, các nguồn nitơ hữu cơ
thường được dùng để sản xuất sinh khối thraustochytrid như: peptone, tryptone, cao nấm men, dịch chiết ngô… [45]. Mặc dù khi sử dụng cao nấm men làm nguồn nitơ,
Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381 tạo ra lượng sinh khối khô cao nhất, nhưng khi sử dụng dịch chiết ngô làm nguồn nitơ lại cho lượng axit béo tổng số và DHA ở mức cao nhất đạt 1,7 g/l (chiếm 37% axit béo tổng số) và cao hơn mức Lipit tích lũy trong các môi trường bổ sung cao nấm men hay ammonium sulfate [57]. Tỉ lệ C/N cao cũng tăng cường khả năng tích lũy Lipit. Ví dụ như A. limacinum ATCC MYA-1381 tích lũy 77.5% Lipit khi sinh trưởng trong môi trường C/N = 51.9. Tỉ lệ C/N = 39.1 lại thích hợp cho Thraustochytrid sp. G13 tích lũy hàm lượng Lipit lên tới 78% sinh khối [57].
1.3.1.3. Các chất dinh dưỡng khác
Bên cạnh nitơ và cacbon là nguồn dinh dưỡng không thể thiếu, phospho, natri và các yếu tố vết, vitamin cũng cần thiết cho sinh trưởng và tích lũy Lipit của vi tảo Thraustochytrid [19]. Ngoài ra, như trình bày ở phần trên thì việc bổ sung axit
acetic cũng làm tăng lượng DHA được tạo ra, tuy rằng cơ chếlàm tăng lượng DHA
theo con đường FAS hay PKS vẫn còn gây nhiều tranh cãi [15, 47]. Nhìn chung,
việc tối ưu nồng độ các chất tiền chất thích hợp sẽ hỗ trợ cho việc sinh trưởng và sản xuất DHA của thraustochytrid.
1.3.2. Hệ thống ni cấy
Có nhiều hệ thống ni cấy tảo dị dưỡng bao gồm: lên men theo mẻ (batch), lên men mẻ bổ sung cơ chất (fed-batch), lên men liên tục (continuous),… Đối với
Thraustochytrid, phương thức nuôi cấy chủ yếu vẫn là lên men theo mẻ [17]. Tuy nhiên, hệ thống lên men mẻ bổ sung cơ chất có ưu điểm hơn lên men theo mẻ khi cơ chất được bổ sung vào hệ thống lên men, giúp cung cấp đầy đủdinh dưỡng cho vi tảo, nhờ đó mà lượng DHA tạo thành cao hơn. Ở thí nghiệm ni cấy T. roseum ATCC 28210, sau 8 ngày, sinh khối (g/l) và hàm lượng DHA (mg/l) tạo thành ở các trường hợp không bổsung cơ chất, bổ sung tinh bột, bổ sung glucose lần lượt là: 6 – 50,12.1 – 1433 , 7 – 1130 [51].
1.3.3. Pha sinh trưởng
Các pha sinh trưởng có ảnh hưởng lớn tới quá trình sản xuất Lipit ở các vi sinh vật cho dầu. Sự tích lũy Lipit ở thraustochytrid tuân đúng theo đường cong sinh trưởng, với lượng PUFA cao nhất thu được ở cuối pha log và đầu pha cân bằng. Quá trình sản xuất DHA ở thraustochytrid hiệu quả nhất từ ngày nuôi cấy thứ 2 tới ngày thứ4, tương ứng cuối pha log và đầu pha cân bằng [17].
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mười chủng thraustochytrid được phân lập từ mẫu nước và lá cây trong giai đoạn phân hủy thu thập từ 6 vị trí ở Rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định bao gồm vùng đệm và vùng lõi (hình 2.1). Mẫu được thu thập từ các vị trí khác nhau với sựđa dạng vềđộpH và độ mặn.