Lấy 200 μl huyền phù tế bào HaCaT và SK-Mel 28 mật độ 500 000 tb/ml vào 3 ống eppendorf được kí hiệu lần lượt là: HaCaT tế bào gốc, HaCaT-M1, HaCaT-M2 tương ứng là tế bào HaCaT không gắn hạt, tế bào HaCaT gắn hạt với tỉ lệ 9x10-3 mg hạt/100.000 tế bào và 27x10-3 mg hạt/ tế bào. (Bảng 2.1). Tương tự đối với tế bào SK-Mel 28 ta cũng kí hiệu mẫu như sau: SK-Mel 28 tế bào gốc, SK- Mel28-M1 và SK-Mel28-M2.
Với mỗi dòng tế bào HaCaT và SK-Mel 28, bổ sung 50 μl hạt nano Fe3O4/Ag-NH2-anti EGFR vào mỗi ống Eppendorf chứa mẫu HaCaT-M1 và SK- Mel28-M1, đồng thời nhỏ 150 μl hạt nano vào mỗi Eppendorf chứa mẫu HaCaT-M2, và SK-Mel28-M2. Bổ sung dung môi PBS vào hai mẫu đối chứng và M1 của cả hai dòng tế bào Hacat và SK-Mel 28 sao cho thể tích cuối cùng là 650 μl. Sau đó đem ủ tế bào ở nhiệt độ phòng trong 1 tiếng rồi đem bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ 40C từ 14-16 h. Sản phẩm cuối cùng thu được là dung dịch huyền phù tế bào HaCaT và SK-Mel 28 gắn với hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag.
Bảng 2.1. Bảng tỉ lệ hạt nano Fe3O4/Ag-NH2-anti EGFR gắn với tế bào
Loại mẫu Thể tích hạt nano Fe3O4/Ag- NH2-anti EGFR sử dụng
Tỉ lệ khối lƣợng hạt/số tế bào
M1 50 μl 9x10-3 mg/100.000 tế bào
M2 150 μl 27x10-3mg/100.000 tế bào
Tế bào gắn hạt nano sau đó được lấy ra, dùng nam châm thu lại các hạt nano Fe3O4/Ag. Khi đó, các tế bào gắn kết được với các hạt nano sẽ bị điều khiển và định hướng theo từ trường ngoài của nam châm. Các tế bào không gắn hạt nano sẽ tồn tại trong dung dịch dưới dạng huyền phù và không bị định hướng bởi từ trường ngoài.
Dùng phương pháp đếm mật độ tế bào trong buồng đếm ta có thể tính tốn được hiệu suất gắn kết hạt nano với tế bào.
Các mẫu tế bào sau đó được mang đi khảo sát ảnh hiển vi trường tối và phổ Raman tăng cường bề mặt.
2.2.3. Khảo sát hiệu suất gắn tế bào
Dùng nam châm điều khiển và tách lọc những tế bào đã được gắn kết với hạt nano ra khỏi tế bào chưa gắn kết được với hạt. Sử dụng pipet hút những tế bào không gắn kết với hạt nano và mang đi đếm nhằm xác định hiệu suất tách chiết từ đó có thể kết luận một cách tương đối hiệu suất gắn kết hạt nano với tế bào.
Sau khi gắn hạt nano với hai dịng tế bào Hacat và SK-Mel28, chúng tơi tiến hành các phép phân tích sau:
Các kỹ thuật phân tích:
Chụp ảnh hiển vi trường tối (Dark field microscopy)
Phổ Tán xạ Raman
2.2.4. Quy trình tiến hành các kỹ thuật phân tích 2.2.4.1. Máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis)
Các mẫu cần khảo sát phổ UV-Vis được đo bởi máy UV-2450PC tại Trung tâm Khoa học Vật liệu – khoa Vật lý – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội.
Các bước tiến hành như sau:
Cài đặt máy, điều chỉnh chế độ đo trên màn hình máy tính như sau: - Chế độ đo hấp thụ (Absorbance),
- Bước sóng từ 300-800 nm
- Tốc độ quét trung bình (Medium).
Sau khi cài đặt máy, nhỏ 4 mL nước cất vào 2 curvet thạch anh phần đựng mẫu chuẩn và mẫu cần đo trong buồng chứa mẫu sau đó nhấn Baseline để các giá trị cường độ về 0. Sau khi Baseline xong, ta đem mẫu vào và bắt đầu tiến hành đo. Kết quả thu được là phổ hấp thụ UV-Vis hiển thị trên màn hình máy tính. Lưu kết quả bằng file text sau đó vẽ và xử lý lại bằng phần mềm Origin.
2.2.4.2. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD)
Các mẫu đo được khảo sát bằng giản đồ nhiễu xạ tia X sử dụng máy bruker – AXS D5005 của hãng Siemens tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, khoa Vật lý, trường Đại học Khoa học tự nhiên.
Chế độ làm việc của ống tia X sử dụng bức xạ Cu-Kα1 có bước sóng 1,54056Å, cường độ dịng điện bằng 30 mA, điện áp 40kV.
- Góc qt 2θ=10÷700 - Tốc độ quét: 0.03○/s
- Thời gian dừng sau mỗi bước là: 1s
Mẫu được sấy khô thành dạng bột, lưu trong ống Eppendorf sau đó được gửi đi khảo sát phổ XRD.
2.2.4.3. Phổ tán xạ năng lƣợng tia X (EDS)
Mẫu được khảo sát tỉ phần các nguyên tố bằng phổ tán xạ năng lượng tia X sử dụng máy Nova NanoSEM 450 Fei tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, khoa Vật lý, trường Đại học Khoa học tự nhiên.
Mẫu được sấy khơ thành dạng bột, lưu trong ống Eppendorf sau đó được gửi đi khảo sát phổ EDS.
2.2.4.4. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Hình thái hạt nano Fe3O4 được khảo sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW, số 1 Yecxanh, Hai Bà trưng, Hà Nội.
Các bước tiến hành:
Mẫu được phân tán đều trong dung môi cồn với nồng độ vừa đủ, lưu mẫu trong ống Eppendorf, Rung siêu âm 30-40 phút trước khi gửi mẫu khảo sát.
2.2.4.5. Đƣờng cong từ hóa đƣợc đo ở nhiệt độ phòng bằng hệ từ kế mẫu rung (VSM)
Mẫu được khảo sát độ từ hóa bằng thiết bị từ kế mẫu rung DMS 880 của hãng Digital Measurement Systems (Mỹ) với từ trường cực đại là 13,5 KOe tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Đại học Khoa học Tự nhiên.
Các bước tiến hành:
sao cho khối lượng mẫu từ 3-7 mg. Ghi lại giá trị khối lượng cụ thể của từng mẫu đo và gửi đi khảo sát độ từ hóa.
2.2.4.6. Chụp ảnh hiển vi trƣờng tối (Dark Field Microscopy)
Mẫu được chụp ảnh hiển vi huỳnh quang trường tối sử dụng hệ máy Axio Plan 2 của hãng Carl Ziess tại Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên.
Các bước tiến hành:
Mẫu khảo sát có dạng dung dịch. Dùng Pipet lấy 10 μL mẫu nhỏ lên lam kính đã được rửa sạch và sấy khơ. Lấy một tấm lamen sạch đặt lên khu vực mẫu vừa nhỏ để mẫu được phân bố đều diện tích của lam kính sau đó để vào giá đựng mẫu vật của kính hiển vi quang học. Tiến hành chụp ảnh trường sáng và trường tối của mẫu ở độ phóng đại của vật kính là 20X.
Phương pháp xử lý kết quả ảnh hiển vi trường tối
Để khảo sát cường độ sáng trung bình của tế bào trước và sau khi gắn hạt nano composite đa chức năng, chúng tôi sử dụng phần mềm phân tích ảnh Image J để tính cường độ sáng trung bình của từng tế bào và nền. Muốn tính cường độ sáng trung bình của nền, trước hết, chúng tơi lựa chọn 1 ơ có diện tích 234x234 pixel. Trong đó được chia thành 256 giá trị đơn vị cường độ từ 0-255 và số điểm ảnh có cường độ tương ứng. Từ đó ta có đồ thị biểu diễn cường độ sáng của tế bào trên 1 đơn vị diện tích. (Hình 2.3)
Sử dụng hàm Histogram trong Image J cho ta một bảng các giá trị có cường độ sáng tương tứng từ 0-255. Từ bảng số liệu này ta vẽ được đồ thị mô tả cường độ sáng của khu vực chứa tế bào và khơng chứa tế bào (nền). Nhìn vào 3 đồ thị (a), (b), (c) trong hình 2.4 ta nhận thấy. Hình dáng và diện tích đồ thị tại vị trí 1 (hình 2.4 c) và vị trí 2 (hình 2.4 b) là tương đối giống nhau. Đồ thị có dạng hình tháp, hơi tù. Tích phân của đường này sẽ cho ta cường độ sáng của tế bào tại vị trí 1 và 2. Tương tự như vậy, tích phân của đường đồ thị 2.4 (a) sẽ cho ta cường độ sáng của nền. Di chuyển ô diện tích tại 5 vị trí xung quanh tế bào để tính cường độ sáng trung bình và xác định sai số. Lặp lại cách tính tương tự với các khu vực chứa tế bào khác và khu vực không chứa tế bào (nền). Lấy cường độ sáng trung bình của khu vực chứa tế bào trừ đi cường độ sáng trung bình của nền ta sẽ thu được cường độ sáng TB của từng tế bào. (Hình 2.4)
Hình 2.4. Đồ thị tính tốn cường độ sáng của tế bào và nền.
Hình 2.4 a: Đồ thị biểu diễn cường độ sáng của nề
Hình 2.4 b: Đồ thị biểu diễn cường độ sáng của tế bào tại vị trí 2 Hình 2.4 c: Đồ thị biểu diễn cường độ sáng của tế bào tại vị trí 1
2.2.4.7. Phổ tán xạ Raman
Mẫu được khảo sát phổ Raman bằng hệ máy Model LabRAM HR, hãng HORIBA Jobin Yvon tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội.
Các bước tiến hành:
Mẫu được nhỏ lên đế lamen sạch, để khô tự nhiên rồi mang đi khảo sát phổ tán xạ Raman.
Các kết quả khảo sát tính chất vật lý của vật liệu được tổng hợp và phân tích trong chương 3 dưới đây.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag
3.1.1. Hạt nano Fe3O4 chức năng hóa với 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) (APTES)
3.1.1.1. Cấu trúc và hình thái học
Giản đồ nhiễu xạ tia X của hạt nano Fe3O4 chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa được biểu diễn trong hình 3.1 dưới đây. Các đỉnh nhiễu xạ ứng với các mặt (220), (311), (400), (422), (511), (440) khớp với phổ chuẩn JCPDS 19-0629.
Các chỉ số này tỉ lệ với khoảng cách các mặt tinh thể theo công thức sau: 2 2 2 l k h a d
Khoảng cách d của các mặt phẳng tinh thể tương ứng trong tinh thể Fe3O4 được tổng hợp trong bảng 3.1. Từ công thức sự phụ thuộc của khoảng cách d tính được từ giản đồ nhiễu xạ tia X và chỉ số h, k, l ta có thể tính được hằng số mạng a.
Bảng 3.1.Khoảng cách d tính được ứng với các mặt nhiễu xạ tia X:
TT Chỉ số Miller 2θ d (Ǻ) 2 2 2 l k h 1 220 30,2 2,967 2,828 2 311 35,6 2,532 3,316 3 400 43,4 2,099 4 4 422 53,9 1,715 4,898 5 511 57,3 1,616 5,196 6 440 63,0 1,484 5,565
Qua tính tốn chúng tơi kết luận mẫu hạt Fe3O4 có cấu trúc lập phương tâm mặt xếp chặt thuộc nhóm khơng gian F3dm và có hằng số mạng a = 8.37±0,04 Å.
Kích thước hạt trung bình được tính từ đỉnh nhiễu xạ (311) tại góc 2θ cỡ 36° trong nhiễu xạ tia X sử dụng công thức Debye-Scherrer như sau:
Trong phương trình này, D là đường kính tinh thể; λ là bước sóng tia X của Cu (Kα) (λ = 0,15406 nm); θ là góc phản xạ Bragg; B là độ bán rộng của đỉnh nhiễu xạ.
cos 9 , 0 B D
Từ cơng thức Debye-Scherrer ở trên ta có sai số của D được tính như sau:
Trong đó B và θ được tính bằng cách fit hàm Gauss tại vị trí đỉnh nhiễu xạ (311). Sau khi tính tốn chúng tơi xác định được tinh thể nano Fe3O4 có kích thước trung bình khoảng 9±2 nm. (Hình 3.1)
Hình 3.2 là ảnh TEM của mẫu Fe3O4. Từ kết quả ảnh TEM này nhận thấy, các hạt nano Fe3O4 có kích thước dao động từ 7-11 nm khá tương đồng với kích thước tinh thể tính tốn từ phổ nhiễu xạ tia X.
Như vậy, hạt nano Fe3O4 chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa có kích thước tương đối đồng đều phù hợp với yêu cầu để tiến hành chế tạo hạt nano composite Fe3O4/Ag.
Hình 3.1. Nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4 Hình 3.2. Ảnh TEM của các hạt nano Fe3O4
3.1.1.2. Tính chất từ của vật liệu
Hình 3.3 là đường cong từ trễ của mẫu Fe3O4. Kết quả này cho ta thấy đường cong là một đường đối xứng, lực kháng từ Hc = 0, mặt khác có thể thấy rằng từ độ dư Mr = 0. Như vậy có thể kết luận rằng các hạt nano Fe3O4 có tính chất siêu thuận từ, nghĩa là khi ngừng tác động của từ trường ngoài, vật liệu sẽ khơng cịn từ tính nữa, hạt khơng bị kết đám do khơng có từ dư. Đây là một đặc điểm rất quan trọng giúp các hạt nano Fe3O4 dễ dàng được điều khiển, tách ra bằng từ trường ngoài hứa hẹn nhiều khả năng ứng dụng trong tách chiết tế bào, dẫn truyền thuốc hướng đích
Bên cạnh đó, kích thước tinh thể thu được từ giản đồ nhiễu xạ tia X và kích thước hạt thu được từ ảnh TEM khá tương đồng hay có thể nói các hạt nano từ là các hạt sắt từ đơn đơmen [29].
Hình 3.3. Đường cong từ trễ của mẫu Fe3O4
Từ kết quả đường cong từ trễ ta thấy, giá trị cao nhất của từ độ đạt 50,37 emu/g vẫn chưa đạt tới giá trị bão hòa, tuy nhiên do tới hạn của thiết bị đo từ trường ngồi có độ lớn là ~1,3 Tesla vì vậy có thể coi gần đúng từ độ bão hịa của vật liệu Fe3O4 là Ms = 50,37 emu/g.
3.1.2. Hạt nano composite Fe3O4/Ag
3.1.2.1. Khảo sát nhiễu xạ tia X (XRD) và phổ tán sắc năng lƣợng EDS.
Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) của mẫu hạt nano composite Fe3O4/Ag trong hình 3.4 cho thấy có cả đỉnh nhiễu xạ của Ag và Fe3O4. Với đỉnh nhiễu xạ tại vị trí các góc 2θ là 38,12o; 44,29o và 64,59o tương ứng với các mặt phẳng tinh thể (111); (200); (220) của tinh thể Ag. Giản đồ này là minh chứng rõ ràng cho việc tồn tại thành phần bạc trong hạt nano composite đã chế tạo [20, 24]. Hơn nữa, quan sát phổ này ta thấy cường độ đỉnh nhiễu xạ của Ag lớn hơn nhiều của Fe3O4, các đỉnh nhiễu xạ của Fe3O4 cũng xuất hiện khơng đầy đủ (chỉ cịn lại các đỉnh tại mặt phẳng nhiễu xạ (220), (311), (422). Điều này có thể do khi chiếu bức xạ tia X vào bề mặt của mẫu, một số mặt phẳng tinh thể của Fe3O4 như (400), (511), (440) tương ứng với
các góc 2θ là 43,4o
; 53,9o; và 63o
bị che lấp bởi các mặt tinh thể (111), (200) và (220) của hạt Ag ứng với góc 2θ lần lượt là 38,1o ; 44,3o và 64,5o. Các hạt nano Ag có thể đã được bám trên bề mặt của hạt nano Fe3O4 tạo thành cấu trúc composite Fe3O4/Ag.
Hình 3.4. Nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4/Ag. Trong đó kí hiệu là đỉnh nhiễu xạ
của Ag và * là đỉnh nhiễu xạ của Fe3O4.
Hình 3.5 thể hiện phổ tán sắc năng lượng tia X của mẫu Fe3O4/Ag. Trong hình chúng tơi có chỉ ra các vị trí các đỉnh tán xạ năng lượng ứng với các vạch tán xạ của các nguyên tố cơ bản.
Bảng 3.2 thể hiện chi tiết tỉ phần các nguyên tố trong mẫu, trong đó nguyên tố Oxi chiếm 55,6(7)%, Fe chiếm 27,9(7)% và nguyên tố Ag chiếm 16,3(6)%. Kết quả này đã khẳng định việc hình thành hạt nano composite Fe3O4/Ag.
Bảng 3.2. Tỉ phần các nguyên tố trong mẫu Fe3O4/Ag
Nguyên tố Tỉ phần các nguyên tố trong mẫu (%)
O 55,6(7)
Fe 27,9(7)
Ag 16,3(6)
Như vậy, kết quả khảo sát nhiễu xạ tia X và phổ tán sắc năng lượng tia X cho thấy, chúng tôi đã chế tạo thành công loại vật liệu composite Fe3O4/Ag.
3.1.2.2. Khảo sát phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến UV-Vis và hình thái học của vật liệu
Các hạt nano kim loại nói chung và hạt nano bạc nói riêng có hiệu ứng plasmon bề mặt đặc trưng. Do đó tại tần số Plasmon, các hạt nano Ag sẽ hấp thụ ánh sáng tốt hơn và tạo thành đỉnh hấp thụ xung quanh vị trí bước sóng khoảng 400 nm. Đồng thời khi kích thước các hạt nano tăng dần đỉnh hấp thụ của dung dịch chứa hạt sẽ dịch chuyển về phía bước sóng dài [34].
Hình 3.7. Phổ UV-Vis và ảnh TEM của hạt nano Ag kích thước từ 25-50 nm
Thông thường, các hạt nano Ag kích thước từ 15-25 nm có đỉnh hấp thụ quang học tại bước sóng xung quanh vị trí 400 nm (hình 3.6), đối với các hạt có kích thước từ 25-50 nm thì có vị trí đỉnh hấp thụ tại khoảng 415 nm (Hình 3.7). Tuy nhiên, trong phổ UV-Vis dưới đây, đỉnh hấp thụ của các hạt nano Fe3O4/Ag xuất hiện tại bước sóng 438.5 nm (hình 3.8 a).
Khi các điện tử tự do dao động trên bề mặt của hạt nano kim loại, tần số dao