C n3 KẾT QUẢ
3.1. Chuẩn hóa quy trình phân lập, ni cấy tế bào γδT trên mẫ un ời khỏe
Sử dụng các nồng độ zoledronate và IL-2 khác nhau, lần lượt là 2,5 mM - 300 IU, 2,5 mM - 600 IU, 5 mM - 300 IU và 5 mM - 600 IU, tiến hành nuôi cấy và xác định tốc độ tăng trưởng của tế bào γδT tại một số thời điểm nuôi cấy. Kết quả được đưa ra trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Số lượng tế bào miễn dịch γδT nuôi cấy ở các nồng độ zoledronate và IL- 2 khác nhau
Ngày nuôi cấy 2,5mM-300 IU 2,5mM-600 IU 5 mM - 300 IU 5 mM - 600 IU Ngày 0 8,5 x 104 8,5 x 104 8,5 x 104 8,5 x 104
Ngày 3 1,2 x 105 1,5 x 105 6,8 x 106 4,4 x 106 Ngày 10 5,8 x 107 7,8 x 107 2,1 x 107 8,0 x 107 Ngày 15 1,8 x 108 2,1 x 108 1,9 x 108 2,6 x 108
Hình 3.1: Đường cong sinh trưởng của tế bào miễn dịch ở các nồng độ zoledromate và IL-2 khác nhau
Số lượng tổng số tế bào thu được sau 14 ngày nuôi cấy tăng sinh đạt cao nhất tại nồng độ zoledronate - IL-2 là 5 mM - 600 mM. Số lượng tế bào đạt trên 2,6 x 108 tế bào là thỏa mãn yêu cầu số lượng tế bào cần đạt được (Hình 3.1).
Hình ảnh tế bào sinh trưởng được minh họa trong hình 3.2. Kết quả cho thấy các tế bào miễn dịch tạo cụm tốt, sinh trưởng tốc độ nhanh nhất ở nồng độ zoledronate/IL-2 là 5 mM/ 600 mM.
Hình 3.2: Hình ảnh tế bào miễn dịch γδT sau nuôi cấy tại các nồng độ zoledronate/IL-2 khác nhau
A. 2.5mM/300IU; B. 5mM/300IU; C. 2.5mM/600IU; D. 5mM/600IU
Tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được sau 14 ngày nuôi cấy tăng sinh tại các nồng độ zoledronate và IL-2 khác nhau được trình bày trong hình 3.3 và bảng 3.2. Bằng kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (Flow cytometry), nhuộm với các kháng thể kháng CD3, CD8, CD4 có thể xác định được tỷ lệ nhóm tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được. Tế bào γδT sẽ biểu hiện CD3+/CD8-/CD4- trên bề mặt tế
A B
bào, phân biệt với quần thể tế bào T độc biểu hiện CD3+/CD8+ và quần thể tế bào T trợ giúp biểu hiện CD3+/CD4+ trên bề mặt tế bào
Hình 3.3: Hình ảnh xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy tại các nồng độ zoledronate và IL-2 khác nhau.
A. 2,5mM/300IU; B. 5mM/300IU; C. 2,5mM/600IU; D. 5mM/600IU
A
B
C
Tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy được nêu rõ trong bảng 3.2. Kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào lympho T đạt tỷ lệ cao nhất, 96.6% ở nồng độ zoledronate và IL-2 là 5mM và 600IU/ml. Tỷ lệ tế bào γδT ở cả 3 điều kiện ni cấy tăng sinh, hoạt hóa đều đạt trên 95% tổng số tế bào T thu được.
N vậy, nồng dộ zoledronate và IL-2 tối u c o nuôi cấy tăn sin , hoạt hóa tế bào γδT lần l ợt là 5mM và 600IU/ml.
Bảng 3.2: Tỷ lệ tế bào lympho T và γδT trong quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy
Tỷ lệ 2.5mM- 300 IU 2.5mM- 600 IU 5mM- 300 IU 5mM- 600 IU Tế bào T (CD3+) 93,9% 94,7% 94,3% 96,6% Tế bào γδT (CD3+/CD4-/CD8-) 95,5% 95,7% 95,7% 96,7%
Mười ml máu tĩnh mạch người tình nguyện khỏe mạnh được thu thập vào ống chống đông EDTA để phân lập tế bào Lympho sử dụng cho nghiên cứu. Hiện nay có nhiều kỹ thuật khác nhau để phân lập tế bào Lympho hoặc các tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi bao gồm phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll truyền thống và sử dụng các ống chuẩn bị tế bào (cell preparation tubes - CPTs) hoặc các ống SepMate sử dụng Lymphoprep [41]. Trong số này, phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll truyền thống được đánh giá là phương pháp hiệu quả nhất với giá thành rẻ, số lượng tế bào thu được, tỷ lệ sống và chức năng của tế bào sau khi phân lập cao hơn 2 phương pháp còn lại mặc dù đòi hỏi nhiều thao tác và thời gian hơn [87]. Bên cạnh đó, tỷ lệ các loại tế bào miễn dịch thu được và quan trọng nhất là profile biểu hiện gen của các tế bào này không bị ảnh hưởng [19]. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll truyền thống để phân tách tế bào Lympho từ máu ngoại vi. Đây là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện được sử dụng để tinh sạch các dòng tế bào tùy theo mục đích. Mặc dù phương pháp này không đem đến một số lượng lớn tế bào như các phương
pháp ly giải tế bào đơn thuần nhưng ưu điểm của nó là loại bỏ được được hầu hết các bạch cầu hạt - quần thể tế bào chiếm khoảng 60% bạch cầu trong máu ngoại vi và do đó rút ngắn thời gian tiến hành. Một ưu điểm nữa của phương pháp này đó là có thể loại bỏ các tế bào không sống trong mẫu máu ngoại vi [21].
Nguyên lý của phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll dựa vào tỷ trọng của Ficoll và tỷ trọng của tế bào máu: tỷ trọng của Ficoll là 1,077, cao hơn tỷ trọng của bạch cầu Lympho nhưng lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Khi ly tâm, hồng cầu và bạch cầu hạt lắng xuống đáy ống ly tâm, còn bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân khác nằm ở trên lớp Ficoll. Thu hoạch lớp tế bào ở trên lớp Ficoll rất giàu tế bào Lympho.
Trong nghiên cứu này, số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở người tình nguyện khỏe mạnh trung bình là 2,0 x 106 tế bào. Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%, với tỷ lệ sống trung bình đạt 94%. Kết quả này tương tự như các kết quả trong các nghiên cứu khác với số lượng tế bào thu được sau khi phân lập từ 10 mL máu ngoại vi người khỏe mạnh là 1,16-1,58 x 106
tế bào/mL và tỷ lệ tế bào sống từ 94,5-97,1% [87,19].
Trong quần thể tế bào thu được, tế bào lympho chiếm đa số với tỷ lệ trung bình 80,5%. Trong đó tỷ lệ tế bào γδT chiếm trung bình 5,8%. Kết quả này phù hợp với những báo cáo cho biết tỷ lệ tế bào γδT chiếm từ 1-5% trong máu ngoại vi. Kết quả này cũng tương tự với một số nghiên cứu khác, khi phân lập, nuôi cấy tế bào γδT từ máu ngoại vi.
Kết quả trên đã đạt yêu cầu đưa ra cho chất lượng tế bào thu được sau phân lập từ máu ngoại vi người bình thường: số lượng ≥ 106 tế bào, tỷ lệ sống ≥ 80%, đảm bảo yêu cầu cho giai đoạn ni cấy hoạt hóa tiếp theo.
Các tế bào lympho T phân lập từ máu ngoại vi phần lớn không tiếp xúc trực tiếp với các tế bào ung thư do đó chúng có thể ở trạng thái chưa hoạt hố và ít có tính đặc hiệu với kháng nguyên ung thư cũng như không đủ số lượng cần thiết cho
điều trị. Chính vì vậy, sau khi được thu thập, các tế bào lympho T được nuôi cấy tăng sinh hoạt hóa và tăng độ mẫn cảm với các tế bào ung thư [97].
Tế bào T được hoạt hóa bởi kháng nguyên phospho như HMB-PP hay IPP, thông qua con đường mevalonate. Wilhelm và cộng sự (2003) đã tiến hành hoạt hóa tăng sinh thành cơng tế bào T sử dụng pamidronate kết hợp với IL-2 trên bệnh nhân u lympho [137].
Các kháng nguyên biphosphonate được chia làm 3 lớp. Lớp đầu tiên là các biphosphonate tương tự pyrophosphate, như clodronate và etidronate, có vai trị ức chế các enzyme phụ thuộc ATP. Lớp thứ hai được sử dụng rộng rãi gần đây là các biphosphonate chứa nitơ, như alendronate, pamidronate... Lớp thứ ba là các biphosphonate chứa nhóm amin.
Tế bào T sử dụng cho liệu pháp miễn dịch tự thân đã được thử nghiệm hoạt hóa và tăng sinh theo nhiều con đường khác nhau. Kháng nguyên phospho nhân tạo như bromophydin pyrophosphate (BrHPP) và 2-methyl-3-butenyl-1- pyrophosphate (2M3B1PP) đã được sử dụng để hoạt hóa tế bào T, ứng dụng trong thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân ung thư biểu mô thận [124].
Zoledronate thuộc lớp biphosphonate chứa nhóm amin. Chức năng cơ bản của zoledronate là ức chế Farensyl pyrophosphate (FPP) synthase, một enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp mevalonate, gây tích lũy isopentenyl pyrophosphate (IPP) trong tế bào. IPP có khả năng hoạt hóa tế bào T phụ thuộc thụ thể TCR.
Bên cạnh đó, nhằm tăng sinh các tế bào lympho T đạt số lượng lớn đủ cho điều trị, đồng thời vẫn bảo tồn được các đặc tính, chức năng miễn dịch của tế bào, môi trường nuôi cấy tế bào cần phải bổ sung thêm các cytokin như IL-2, IL-15 và IL-21. IL-2 có vai trị kích thích phân bào, tăng cường sự sống sót đồng thời duy trì tác dụng của các tế bào lympho T tại tổ chức ung thư thông qua phức hợp thụ thể trimeric () trên bề mặt các tế bào này. Để xác định các điều kiện tối ưu cho nuôi
nghiên cứu đã chứng minh được tác động của việc bổ sung cytokine lên tỷ lệ tăng sinh tế bào. Teschner và cộng sự (2011) nhận thấy các tế bào tăng sinh gấp 15-17 lần khi nuôi cấy trong 2 tuần với các hạt phủ kháng thể kháng CD3 và kháng thể kháng CD28 có bổ sung IL-2 so với chỉ nuôi cấy với IL-2 [122]. Một nghiên cứu khác cho thấy việc bổ sung IL-2 không cần thiết đối với các tế bào lympho TCD4+ được kích thích bởi các hạt phủ kháng thể kháng CD3+/CD28+, vì IL-2 tự tiết là đủ để hỗ trợ sự tăng sinh của chúng. Hơn nữa, nuôi cấy tế bào ở nồng độ IL-2 thấp khiến cho ít tế bào hơn trong quần thể tế bào đi vào phân bào và các tế bào mất nhiều thời gian hơn để hoàn thành các phân chia tiếp theo [24]. Ngược lại, nghiên cứu của Cornish và cộng sự báo cáo rằng IL-2 gây ra sự khác biệt giữa các tế bào lympho TCD8+ hiệu ứng và sự kích thích IL-2 gây ra tổng hợp protein cần thiết cho sự phân bào và tăng kích thước tế bào [20].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kết hợp zoledronate và IL-2 để ni cấy hoạt hóa và tăng sinh tế bào γδT. Theo đó, chuẩn hóa được nồng độ zoledronate và IL-2 thích hợp cho tế bào γδT phát triển là vô cùng quan trọng. Nồng độ của zoledronate và IL-2 được chọn để nghiên cứu lần lượt là: 2,5 mM/300IU/ml, 2,5 mM/600IU/ml, 5 mM/300IU/ml và 5 mM/600IU/ml. Kết quả cho thấy tại nồng độ zoledronate 5 mM và IL-2 600 IU/ml, tế bào γδT phát triển nhanh nhất về số lượng, hình thái cũng như tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy. Sau 14 ngày nuôi cấy, số lượng tế bào γδT thu được gấp 1530 lần so với ngày đầu nuôi cấy. Kết quả này cũng tương đồng với một số nghiên cứu khác trên thế giới. Kondo và cs (2008) sử dụng nồng độ 5 mM zoledronate và 1000 IU/ml để ni cấy hoạt hóa và tăng sinh tế bào γδT, thu được số tế bào γδT tăng thêm 4798 lần so với ngày đầu nuôi cấy [61]. Trong nghiên cứu của Li và cộng sự (2010), khi sử dụng kết hợp zoledronate cùng 2 loại cytokine là IL-2 và IL-18, thu được lượng tế bào γδT tăng gấp 1000 đến 5000 lần so với ngày đầu tiên [71]. Tương tự là nghiên cứu của Van Acker và cộng sự (2016), sử dụng zoledronate kết hợp cùng IL- 2 và IL-15, tăng sinh được lượng tế bào γδT gấp 1000 lần so với ngày đầu nuôi cấy [129].
Qua đó có thể xác định nồng độ 5 mM zoledronate và 600 IU/ml IL2 là tối ưu cho sự hoạt hóa và tăng sinh của tế bào γδT và sẽ được sử dụng để nuôi cấy tế bào γδT phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.