Ở giai đoạn 2, 100 µL dung dịch NaOH 0,1M được thêm vào ống thủy tinh đáy nhọn (ống đã thu pha dung môi chiết của giai đoạn 1), rung lắc vortex trong một thời gian nhất định. Trong quá trình lắc, các phenol ở dạng phân tử trung hịa chuyển thành
các ion phenolat và tan vào trong pha dung môi chiết (dung dịch NaOH 0,1M với pH = 13). Sau khi ly tâm 6 phút với tốc độ 1600 vòng/phút, dịch chiết cuối nằm ở đáy
ống thủy tinh đáy nhọn là pha dung dịch NaOH sẽ được chuyển vào vial bằng pipet Pasteur và sẵn sàng cho phân tích trên thiết bị CE-UV.
2.3.2.1 Khảo sát dung môi / hệ dung môi chiết
Sáu loại dung môi là: n-pentan, n-hexan, isooctan, CCl4, 1-octanol và 1-hexanol (gồm dung mơi phân cực, khơng phân cực và ít phân cực) với cùng thể tích 5 ml được sử dụng cho quy trình chiết hai giai đoạn nói trên để lựa chọn dung mơi phù hợp. Các điều kiện khác được cố định là: thể tích mẫu phân tích 150 ml ở pH = 2, dịch chiết là 100 µL dung dịch NaOH 0,1M, các thời gian lắc-chiết trong 2 phút. Ngoài ra, một số trường hợp khi chiết dung môi chiết là đơn dung môi nếu không thu được kết quả như mong muốn thì các hệ dung môi chiết đa dung môi được khảo sát.
2.3.2.2 Khảo sát tỉ lệ các thành phần của dung môi chiết
Sau khi chọn được dung mơi chiết thích hợp, nếu dung mơi chiết là hỗn hợp của các dung mơi khác nhau thì tỉ lệ các dung mơi này trong hệ dung môi chiết sẽ được khảo sát và tối ưu. Hỗn hợp dung môi với giá trị tỉ lệ trong dung môi cần được khảo
sát trong các tỉ lệ khác nhau dao động từ 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30 tới 80:20.
2.3.2.3 Khảo sát thể tích của dung môi chiết
Sau khi chọn được dung môi chiết (là đơn dung môi hoặc hệ dung môi) phù hợp và tối ưu, thể tích dung mơi chiết (là đơn dung môi hoặc hệ dung môi) được khảo sát với khoảng giá trị từ 2,5 ml đên 17,5 ml.
2.3.2.4 Khảo sát thời gian lắc chiết trong giai đoạn 1 và giai đoạn 2
Thời gian lắc chiết cũng ảnh hưởng tới hiệu quả của quá trình chiết. Thời gian
lắc chiết giai đoạn 1 và 2 được lần lượt khảo sát với thời gian lắc 1 phút, 2 phút, 3 phút và 4 phút.
2.4 Xác định các thông số đánh giá hiệu quả phương pháp phân tích
2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD) bao gồm giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và giới
hạn phát hiện của phương pháp (MDL).
IDL là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà thiết bị phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu nền. IDL được xác định bằng cách phân tích nồng độ chất chuẩn cho tín hiệu nhỏ nhất cịn có thể thu được (giả sử là nồng độ C1, chiều cao pic tín hiệu là H1). Nhiễu nền dạng pic có chiều cao Hnền. IDL được tính theo cơng thức: IDL = (3Hnền x C1)/ H1.
MDL là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được so với mẫu trắng. MDL được xác định bằng cách phân tích nồng độ mẫu thêm chuẩn sau khi đã tính hiệu suất (H%), hệ số làm giàu (K lần) của quá trình xử lý và làm giàu mẫu. MDL = IDL x K x H%.
Giới hạn định lượng (LOQ) bao gồm giới hạn định lượng của thiết bị (IQL) và
giới hạn định lượng của phương pháp (MQL). IQL xác định theo tỉ số IQL/IDL bằng 10/3. MQL là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích có thể
định lượng được so với mẫu trắng. MQL được xác định theo tỉ số MQL/MDL bằng 10/3.
2.4.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một chất phân tích là khoảng nồng độ mà tại đó giá trị nồng độ chất phân tích và giá trị tín hiệu tương ứng đo được của chất phân tích trên thiết bị cịn tỉ lệ thuận với nhau. Trong phân tích định lượng, khi xác định giá trị nồng độ chất phân tích trong mẫu thực (nồng độ chưa biết) từ những nồng độ đã biết (mẫu chuẩn) thì việc xác định khoảng tuyến tính rất quan trọng. Nó cho biết nồng độ giới hạn cho kết quả tính bằng phương pháp định lượng cịn đúng hay khơng.
Khoảng tuyến tính được xác định bằng cách đo mẫu chuẩn với nồng độ tăng dần cho tới khi giá trị nồng độ cao nhất khơng cịn sự tuyến tính tốt với các điểm nồng độ thấp hơn (R2 < 0,995).
Dựa trên khoảng tuyến tính và nhu cầu thực khi phân tích mẫu mơi trường, đường chuẩn được dựng với khoảng đường chuẩn phù hợp tùy thuộc vào đối tượng mẫu trong nghiên cứu (mẫu nước mặt, mẫu nước thải làng nghề hay nước thải công nghiệp). Các thông số đánh giá cho đường chuẩn thường là:
- Đánh giá độ tuyến tính của đường chuẩn quan hệ số tương quan tuyến tính R2. - Đánh giá độ đúng đường chuẩn qua hiệu suất thu hồi khi phân tích mẫu chuẩn.
2.4.3 Độ chính xác của phương pháp 2.4.3.1 Độ chụm của phương pháp 2.4.3.1 Độ chụm của phương pháp
Độ chụm là mức độ gần nhau giữa các kết quả thử nghiệm độc lập nhận được trong điều kiện quy định. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào phân bố của sai số ngẫu nhiên và không liên quan tới giá trị thực hoặc giá trị đã xác định. Thước đo độ chụm thường được thể hiện bằng độ phân tán và được tính tốn như là độ lệch chuẩn (độ lệch chuẩn tương đối) của các kết quả thử nghiệm độc lập. "Các kết quả thử nghiệm độc lập" có nghĩa là những kết quả nhận được theo cách không bị ảnh hưởng bởi bất cứ kết quả
nào trước đó trên đối tượng thử như nhau hoặc tương tự như nhau. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn (độ lệch chuẩn tương đối) càng lớn [7]. Trong độ chụm của phương pháp, độ chụm lặp lại và độ chụm tái lặp lại là những thông số bắt buộc phải khảo sát.
Độ chụm lặp lại (độ lặp lại), là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi và giá trị
trung bình trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau. Độ lặp lại thường được xác định thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Khi độ lệch chuẩn tương đối này càng lớn thì sự sai khác giữa các kết quả phân tích liên tục càng lớn, sai số của phép phân tích càng lớn. Độ lặp lại đối với phân tích mẫu nước được xác định bằng cách
tính RSD (%) khi phân tích lặp 11 lần mẫu chuẩn hỗn hợp phenol, 2-NP, 4-NP và 2-M-4,6-DNP có cùng nồng độ 2 mg/L.
Độ chụm tái lặp lại (độ tái lặp), là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi và giá
trị trung bình được thực hiện trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau trong nhiều ngày liên tục. Độ tái lặp lại cũng được xác định thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Khi độ lệch chuẩn tương đối này càng lớn thì sự sai khác giữa các kết quả phân tích của các ngày liên tục càng lớn, sai số của phép phân tích càng lớn. Độ tái lặp lại đối với phân tích mẫu nước được xác định bằng cách tính RSD (%) khi phân tích tái lặp 7 ngày mẫu chuẩn hỗn hợp phenol, 2-NP, 4-NP và 2-M-4,6-DNP có cùng nồng độ 2 mg/L.
Độ lệch chuẩn tương đối được tính như sau [7]:
2 1 RSD % = .100%; ( ) 1 n i i SD x SD n x x (11) Trong đó: RSD: độ lệch chuẩn tương đối
SD: độ lệch chuẩn
:
x giá trị trung bình xi: giá trị đo được
2.4.3.2 Độ đúng của phương pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng cách xác định hiệu suất thu hồi. Hiệu suất thu hồi được tính theo cơng thức (12) [7]: m+c m c C C R% 100% C (12) Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn
Cm: Nồng độ trong mẫu Cc: Nồng độ chuẩn thêm
Độ đúng được xác định bằng hiệu suất thu hồi (%) khi phân tích mẫu thêm chuẩn (là mẫu thực được thêm chuẩn nồng độ xác định). Trong nghiên cứu, mẫu phân tích (mẫu NM.1) được thêm chuẩn hỗn hợp của phenol, 4-NP, 2-NP và 2-M-4,6-DNP sao
cho nồng độ trong mẫu phân tích là 6,67 µg/L, hệ số làm giàu (1500 x Hc) lần với Hc là hiệu suất chiết của chất phân tích.
2.5 Áp dụng phân tích mẫu thực
Mẫu thực là các mẫu nước được xử lý mẫu sơ bộ tại hiện trường và xử lý, làm giàu bằng quy trình chiết lỏng – lỏng tối ưu tại phịng thí nghiệm. Dịch chiết cuối được đem đo trên hệ CE-UV với các điều kiện phân tích đã tối ưu.
Đồng thời với phân tích trên hệ CE-UV, một phần mẫu thực (dịch chiết cuối sau khi đã xử lý và làm giàu) được phân tích đối chứng bằng phương pháp HPLC-DAD.
Các điều kiện phân tích trên thiết bị HPLC-DAD: Cột C18 Shim-pack VP-ODS (4,6 mm i.d. x 150 mm, kích thước hạt 4,6 µm), nhiệt độ lị cột 38oC; pha động gồm
pha A (acetonitril) và pha B (dung dịch H2SO4 có pH=3,2), tốc độ dịng 1ml/phút; detector mảng diot với bước sóng lựa chọn ở 220 nm; thể tích mẫu 10µL (hút bằng micro xy-lanh HPLC).
3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát và tối ưu các điều kiện phân tích trên thiết bị CE-UV 3.1.1 Khảo sát và tối ưu pH của dung dịch điện ly nền
Đối tượng phenol và các dẫn xuất của phenol đều có tính axit yếu. Vì vậy, ở điều kiện pH cao (pH ≥ 10), các phenol ở dạng các anion phenolat có thể phân tích bằng phương pháp điện di mao quản. Về lý thuyết, khi áp điện thế, các ion phenolat sẽ di chuyển đến cực dương của hệ điện di. Tuy nhiên thực tế, các ion này lại di chuyển đến cực âm bởi ở điều kiện pH cao dòng điện di thẩm thấu (EOF), là dịng hình thành trong mao quản, có cường độ mạnh và có chiều di chuyển từ dương sang âm sẽ lôi cuốn các ion phenolat khiến các ion này đảo chiều về hướng phân cực âm. Trong phương pháp điện di mao quản, kỹ thuật dùng dung dịch điện ly nền với pH cao khiến cho các chất phân tích ở dạng anion di chuyển ngược dịng về phía điện tích âm được gọi là kỹ thuật phân cực ngược. Dung dịch điện ly nền thích hợp cho kỹ thuật này được chọn là dung dịch borat (được chuẩn bị từ borac và NaOH).
Hình 3.2. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch điện ly nền tới tín hiệu phân tích và thời gian di chuyển của các phenol
Điều kiện pH dung dịch điện ly nền được khảo sát đầu tiên với khoảng khảo sát từ 10 đến 12. Kết quả trên hình 3.1 và 3.2 cho thấy theo chiều tăng giá trị pH: thời gian di chuyển của từng hợp chất phenol tăng, tổng thời gian phân tích cũng tăng dần (từ 1156 giây lên đến 2843 giây). Về độ lớn tín hiệu phân tích: diện tích pic phenol và pic 2-M-4,6-DNP có xu hướng tăng lên. Hai pic tín hiệu của 2-NP và 4-NP bị trùng vào nhau thì theo chiều tăng dần của giá trị pH, pic 4-NP có xu hướng lùi về phía sau và tách ra khỏi pic 2-NP ở điều kiện pH ≥ 11,75 (hình 3.1). Kết quả này được lý giải là do khi pH tăng (nồng độ NaOH thêm vào để điều chỉnh pH tăng) dẫn tới mật độ ion ở lớp điện kép trên thành mao quản (hình 1.5) tăng lên, khi các phenol di chuyển trong mao quản thì bị lớp điện kép này hút và giữ lại làm cho tốc độ di chuyển trong mao quản giảm đi, thời gian phân tích dài hơn. Ngồi ra, sự tăng độ nhớt của dung dịch (cũng là sự tăng nồng độ NaOH thêm vào để điều chỉnh pH) cũng làm giảm tốc độ di chuyển của các ion phenolat và cũng dẫn tới thời gian phân tích dài hơn. Kết quả phù hợp với công thức (8) khi độ nhớt dung dịch tăng làm các ion di chuyển chậm lại và tách khỏi nhau. Bởi vậy, khi tăng đến pH = 12 thì thời gian
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 50 100 150 200 250 pH 9 pH 9,5 pH 10 pH 10,5 pH 11 pH 11,5 pH 11,75 pH 12 T hời g ia n phân tí ch (g iâ y ) Diện tí ch pic (m AU .s)
Biểu đồ ảnh hưởng của pH dung dịch điện ly nền tới tín hiệu phân tích và thời gian di chuyển
phân tích quá dài (2843 giây) và các tín hiệu pic nhỏ, tù. Bởi vậy, điều kiện pH = 11,75 được chọn sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.2 Khảo sát và tối ưu của nồng độ borac trong dung dịch điện ly nền
Sau khi đã chọn được điều kiện pH, điều kiện nồng độ borac được khảo sát với khoảng nồng độ borac 5 mmol/L – 75 mmol/L với các giá trị khảo sát là 5, 25, 50 và 75 mmol/L.
Hình 3.3. Giản đồ điện di khảo sát ảnh hưởng của nồng độ borac đến tín hiệu chất phân tích và độ phân giải giữa hai pic 2-NP và 4-NP
Tiếp nối kết quả từ khảo sát pH, sự tách các pic 2-NP và 4-NP được quan tâm
đầu tiên. Kết quả thu được trên hình 3.3 và 3.4: khi nồng độ borac tăng đến 50 mmol/L thì pic 2-NP và 4-NP mới bắt đầu tách khỏi nhau và độ phân giải có xu
hướng tăng dần (độ phân giải giữa hai pic 2-NP và 4-NP ở điều kiện nồng độ 50 mmol/L và 75 mmol/L lần lượt là 1,1 và 4,1). Tuy nhiên khi nồng độ borac quá
chuyển của chất phân tích giảm đi, thời gian phân tích dài ( thời gian phân tích là 3500 giây ở điều kiện nồng độ borac 75mmol/L). Thời gian phân tích dài dẫn tới sự giãn vùng mẫu khiến cho tín hiệu pic 2-M-4,6-DNP và pic 4-NP nhỏ, tù.
Hình 3.4. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ borac đến tín hiệu chất phân tích và độ phân giải giữa hai pic 2-NP và 4-NP
Để tìm được điều kiện nồng độ borac tốt hơn, khoảng nồng độ ở hai phía của
nồng độ borac 50 mmol/L được chia nhỏ hơn và lấy hai giá trị nồng độ borac là 40 mmol/L và 60 mmol/L để tiếp tục khảo sát. Kết quả thu được phù hợp với lý giải
phía ở trên về hiệu quả tách pic 4-NP và pic 2-NP khi tăng nồng độ borac. Khi so với hiệu quả tách chất (độ phân giải giữa hai pic) ở nồng độ 50 mmol/L, hiệu quả tách 2-NP và 4-NP ở nồng độ 40 mmol/L kém hơn (không tách được chất, độ phân giải bằng 0), hiệu quả tách chất ở nồng độ 60 mmol/L tốt hơn (độ phân giải là 1,41). Tiếp tục chia nhỏ nồng độ borac trong khoảng nồng độ từ 50 mmol/L đến 60 mmol/L
lấy điểm nồng độ 55 mmol/L để khảo sát, kết quả thu được độ phân giải hai pic 4-NP và 2-NP ở nồng độ 55 mmol/L đạt 1,35. Tổng hợp các kết quả thu được (hình
3.4), nồng độ borac là 55 mmol/L và 60 mmol/L đều có hiệu quả tách pic 2-NP và pic 4-NP tương đối tốt, ngoài ra tín hiệu phân tích của các phenol (diện tích pic) ở
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5 25 40 50 55 60 75 Độ p hân giải giữa hai pic 2 -NP và 4 -NP Diện tí ch pic (m AU .s) Nồng độ borac (mmol/L)
Ảnh hưởng của nồng độ borac đến tín hiệu phân tích và độ phân giải hai pic 2-NP và 4-NP
hai điều kiện này cũng tương đương nhau. Tuy nhiên, thời gian phân tích ở điều kiện borac 55 mmol/L thời gian phân tích ngắn hơn khoảng 600 giây nên điều kiện nồng độ borac 55 mmol/L được lựa chọn để tiến hành các khảo sát tiếp theo
3.1.3 Khảo sát và tối ưu điều kiện điện thế tách
Sau khi đã tối ưu được các điều kiện dung dịch điện ly nền borat, điều kiện điện thế tách được khảo sát với các giá trị điện thế tách thay đổi từ -14kV đến -19kV (Hình 3.5).
Hình 3.5. Giản đồ điện di khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách đến tín hiệu chất phân tích và độ phân giải giữa hai pic 2-NP và 4-NP