TT Chỉ tiêu PCDD TT Chỉ tiêu PCDF 1 2,3,7,8-TCDD 1 2,3,7,8-TCDF 2 1,2,3,7,8-PeCDD 2 1,2,3,7,8-PeCDF 3 1,2,3,4,7,8-HxCDD 3 2,3,4,7,8-PeCDF 4 1,2,3,6,7,8-HxCDD 4 1,2,3,4,7,8-HxCDF 5 1,2,3,7,8,9-HxCDD 5 1,2,3,6,7,8-HxCDF 6 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 6 1,2,3,7,8,9-HxCDF 7 OCDD 7 2,3,4,6,7,8-HxCDF 8 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 9 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 10 OCDF
2.1.2. Đối tượng phân tích
Đối tượng nghiên cứu của luận văn là các mẫu sữa của các bà mẹ sinh con đầu lòng được thu thập tại bốn phường lân cận sân bay Đà Nẵng gồm An Khê, Khuê Trung, Chính Gián và Hịa Thuận Tây. Người cho mẫu phải có thời gian sống tại những khu vực này ít nhất là 5 năm. Vị trí các phường tiến hành lấy mẫu được đánh dấu trong hình 2.1.
Hình 2.1: Bản đồ lấy mẫu
Số lượng và kí hiệu mẫu được nêu chi tiết trong bảng 2.2. Bảng 2.2 : Số lượng và kí hiệu mẫu đã thu thập
STT Vị trí lấy mẫu Số lượng mẫu Kí hiệu mẫu
1 An Khê (AK) 6 M1 - M6
2 Khuê Trung (KT) 7 M7 – M13
3 Chính Gián (CG) 7 M14 – M20
4 Hòa Thuận Tây (HTT) 7 M21 – M27
2.2. Nội dung nghiên cứu
Luận văn gồm những nội dung cơ bản như sau:
- Tiến hành thu thập 27 mẫu sữa mẹ tại bốn phường lân cận sân bay Đà Nẵng - Đánh giá hiệu quả của phương pháp phân tích Dioxin trong mẫu sữa thu thập tại Đà Nẵng, thông qua các bước:
mẫu trên thiết bị HRGC/HRMS;
+ Kiểm tra độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp phân tích thơng qua phân tích mẫu lặp thêm chuẩn trên nền mẫu sữa bột;
- Áp dụng quy trình đã đánh giá vào phân tích mẫu thực tế; đưa ra kết quả hàm lượng Dioxin phân tích được trong mẫu cũng như hàm lượng tiêu thụ hàng ngày trung bình ở trẻ.
- Đánh giá về tình trạng phơi nhiễm Dioxin ở các bà mẹ sinh sống xung quanh sân bay Đà Nẵng và nguy cơ phơi nhiễm ở trẻ em qua con đường bú sữa.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Phương pháp lấy mẫu
Trước khi tiến hành lấy mẫu, chúng tơi tiến hành thu thập thơng tin của người tình nguyện cho mẫu bao gồm tuổi, thời gian cư trú, thời gian cho trẻ bú sữa, từng sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ sân bay Đà Nẵng (thực phẩm được đánh bắt hoặc nuôi trồng trực tiếp trong sân bay hoặc thực phẩm mua tại các chợ gần sân bay)… và từ đó chọn ra đối tượng phù hợp. Mẫu sữa được thu thập vào tháng 12/2011 với các thơng tin cơ bản được tóm tắt trong bảng 2.3.
Bảng 2.3: Tóm tắt thơng tin mẫu sữa mẹ tại Đà Nẵng
Phường Tuổi Thời gian cư trú (năm) Thời gian cho
bú (tháng)
Tiêu thụ thực phẩm
(%)
TB Khoảng TB Khoảng TB Khoảng
KT (n=6) 30 19-29 22 10-30 5 2-9 11
AK (n=7) 29 25-33 16 16-29 3,5 1-7,5 50
HTT(n=7) 29 23-28 22 5-28 3,5 1-8 -
CG(n=7) 29 22-40 23 13-29 4 1,5-8 22
Phần trăm tiêu thụ thực phẩm của từng phường được tính bằng cách lấy phần trăm số bà mẹ đã từng tiêu thụ thực phẩm có nguồn gốc từ sân bay Đà Nẵng trên tổng số bà mẹ đã phỏng vấn. Trong bốn phường đã lấy mẫu, phường Hịa Thuận
Tây khơng có thơng tin về phần trăm tiêu thụ thực phẩm.
Mẫu được thu thập với thể tích ít nhất 50 mL vào lọ thủy tinh có nắp vặn lót Teflon và được bảo quản lạnh ở nhiệt độ -40C. Sau đó mẫu được vận chuyển về phịng thí nghiệm và được bảo quản ở tủ âm sâu -200C cho đến khi tiến hành phân tích.
2.3.2. Phương pháp phân tích mẫu
Chuẩn bị mẫu:
Trước khi tiến hành phân tích, mẫu được tiến hành đông khô để chuyển từ dạng dung dịch sữa về dạng mẫu bột, dễ dàng cho q trình tách chiết. Mẫu được tiến hành đơng khơ bằng máy đông khô, Unicryo MC6L trong thời gian 24h.
Chuẩn bị mẫu giả:
Trong luận văn này chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát dung mơi chiết và phân tích mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu là sữa bột Similac Gain IQ, Abbot, Hoa Kì với hàm lượng mỡ ghi trên bao bì là 23,8%.
Khảo sát hệ dung môi chiết mẫu
Mẫu được chiết sử dụng hỗn hợp dung môi gồm Hexan, Diclometan và một dung môi phân cực. Yếu tố khảo sát là loại dung môi phân cực Metanol hoặc Etanol và tỉ lệ dung mơi thích hợp. Loại dung môi và tỉ lệ được lựa chọn để tiến hành chiết mẫu phải đảm bảo được hiệu quả chiết mỡ tốt (đánh giá thông qua độ thu hồi mỡ trong mẫu giả).
Chiết mẫu
Dung dịch nội chuẩn được thêm vào hỗn hợp mẫu đã trộn đều với muối Na2SO4 khan. Sau đó hỗn hợp ở trên được tiến hành chiết trên PLE bằng dung mơi thích hợp với chương trình chiết đã được cài đặt trước. Hiệu suất của tồn bộ q trình phân tích được đánh giá thơng qua độ thu hồi của chất nội chuẩn.
Dung dịch chuẩn làm sạch, 37Cl-2,3,7,8-TCDD được thêm vào dịch chiết mẫu trước khi tiến hành làm sạch trên hệ làm sạch bán tư động, hãng Supelco. Sau đó hỗn hợp dịch chiết mẫu và chuẩn được làm sạch trên hệ gồm hai cột Silica đa lớp và cột Cacbon hai lớp. Hiệu suất của quá trình làm sạch được đánh giá dựa trên độ thu hồi của chất chuẩn làm sạch.
Phát hiện và Định lượng trên thiết bị HRGC/HRMS
Phương pháp định lượng các chất Dioxin trên hệ thống HRGC/HRMS được tham khảo từ phương pháp tiêu chuẩn USEPA 1613 với một số thay đổi phù hợp với điều kiện của phịng thí nghiệm. Các thí nghiệm trên hệ thống phân tích bao gồm: xác định các chất Dioxin dựa vào thời gian lưu và mảnh phổ của ion đặc trưng của từng đồng loại, dựng đường chuẩn gồm 5 điểm chuẩn của 17 chất đồng loại Dioxin (với nồng độ của từng đồng loại trong bảng 2.4), xác định các giá trị giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp và định lượng chất phân tích sử dụng đường chuẩn theo phương pháp pha loãng đồng vị và nội chuẩn.
Đánh giá độ đúng và độ chụm của phương pháp
Với hệ dung môi đã khảo sát ở trên, chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu sữa bột và tiến hành phân tích 06 mẫu lặp, hàm lượng của các chất trong dung dịch thêm chuẩn trong phụ lục 2. Độ đúng và độ chụm của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi chất chuẩn và độ lặp lại của phương pháp phân tích.
Phân tích mẫu thực tế
Sau khi đánh giá phương pháp phân tích đảm bảo yêu cầu về độ thu hồi và độ lặp lại cho phương pháp phân tích Dioxin theo phương pháp tiêu chuẩn USEPA 1613, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu thực tế.
2.4. Hóa chất, chất chuẩn, dụng cụ, thiết bị
2.4.1. Hóa chất
Hóa chất sử dụng phải có độ tinh khiết sử dụng cho phân tích, sắc kí khí và sắc kí lỏng do các cơng ty Merck, Aldrich Sigma, Supelco, Fluka…sản xuất, bao gồm:
- n-Hexan (C6H14) - Toluen (C6H5CH3) - Diclometan (CH2Cl2) - Axeton (CH3COCH3) - Metanol (CH3OH) - Etanol (C2H5OH)
- Muối natri sunfat khan (Na2SO4)
2.4.2. Chất chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc sử dụng theo phương pháp tiêu chuẩn EPA - 1613 do công ty Radian Corporation, Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Mỹ) sản xuất gồm có:
- Dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn: C1–C5; 0,5 – 2000 pg/L
- Dung dịch thêm chuẩn: 400 - 4000 pg/L, được sử dụng khi tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn
- Dung dịch chất chuẩn đánh dấu hay dung dịch nội chuẩn: 100 – 200 pg/L, được sử dụng để xác định hiệu suất của tồn bộ q trình phân tích
- Dung dịch chất chuẩn làm sạch: 8,0 pg/L, được sử dụng để xác định hiệu suất của quá trình làm sạch dịch chiết mẫu qua hệ cột làm sạch
- Dung dịch chất chuẩn thu hồi: 200 pg/L, được sử dụng để tính tốn hiệu suất thu hồi của chất chuẩn đánh dấu.
Nồng độ của từng chất chuẩn được biểu diễn trong phụ lục.
Khi dựng đường chuẩn của 17 đồng loại độc của Dioxin, dung dịch chuẩn gốc C1 - C5 được pha loãng, nồng độ dung dịch dựng đường chuẩn (MC1-MC5) trong bảng 2.4.
Bảng 2.4: Nồng độ dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn
TT Tên chất Nồng độ dung dịch (pg/μL)
MC1 MC2 MC3 MC4 MC5
1 2,3,7,8-TCDD 0,05 0,2 1 4 20
3 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,25 1 5 20 100 4 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,25 1 5 20 100 5 1,2,3,7,89-HxCDD 0,25 1 5 20 100 6 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0,25 1 5 20 100 7 OCDD 0,5 2 10 40 200 8 2,3,7,8-TCDF 0,05 0,2 1 4 20 9 1,2,3,7,8-PeCDF 0,25 1 5 20 100 10 2,3,4,7,8-PeCDF 0,25 1 5 20 100 11 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,25 1 5 20 100 12 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,25 1 5 20 100 13 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,25 1 5 20 100 14 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,25 1 5 20 100 15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,25 1 5 20 100 16 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,25 1 5 20 100 17 OCDF 0,5 2 10 40 200 Chất chuẩn đánh dấu 1 13C12-2,3,7,8-TCDD 10 10 10 10 10 2 13C12-1,2,3,7,8-PeCDD 10 10 10 10 10 3 13C12-1,2,3,4,7,8-HxCDD 10 10 10 10 10 4 13C12-1,2,3,6,7,8-HxCDD 10 10 10 10 10 5 13C12-1,2,3,7,89-HxCDD 10 10 10 10 10 6 13C12-1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 10 10 10 10 10 7 13C12-OCDD 20 20 20 20 20 8 13C12-2,3,7,8-TCDF 10 10 10 10 10 9 13C12-1,2,3,7,8-PeCDF 10 10 10 10 10 10 13C12-2,3,4,7,8-PeCDF 10 10 10 10 10 11 13C12-1,2,3,4,7,8-HxCDF 10 10 10 10 10 12 13C12-1,2,3,6,7,8-HxCDF 10 10 10 10 10 13 13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDF 10 10 10 10 10 14 13C12-2,3,4,6,7,8-HxCDF 10 10 10 10 10 15 13C12-1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 10 10 10 10 10 16 13C12-1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 10 10 10 10 10 Chất chuẩn làm sạch 23 37Cl4-2,3,7,8-TCDD 0,05 0,2 1 4 20
Chất chuẩn thu hồi
24 13C12-1,2,3,4-TCDD 10 10 10 10 10
25 13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDD 10 10 10 10 10
2.4.3. Dụng cụ
- Xy lanh, Hamilton (Mỹ);
mL), ống nghiệm (9, 15 mL), vial thủy tinh (2 mL), lọ thủy tinh (150 mL), pipet Pasteur;
- Dụng cụ bảo hộ: áo blouse, mặt nạ than hoạt tính, găng tay.
2.4.4. Thiết bị
- Cân kĩ thuật, Pioneer® Ohaus, độ đọc 0,01g (Mỹ); - Cân phân tích, Sartorious, độ đọc 0,1 mg (Đức);
- Máy đông khô: Unicryo MC6L, Uniequip (Đức); - Máy rung: Vortex mixer, Labnet International (Mỹ);
- Thiết bị chiết lỏng rắn áp suất cao, Fluid Management Systems (Mỹ); - Máy cô quay 4001, Heidolph (Đức);
- Bộ cô N2, Glas-Col (Mỹ);
- Hệ làm sạch (Dioxin Prep System), Supelco (Mỹ); - Thiết bị HRGC/HRMS, Waters (Anh).
2.5. Thực nghiệm
2.5.1. Khảo sát hệ dung môi chiết
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát hai hệ dung môi chiết gồm Hexan/Diclometan/Metanol và Hexan/Diclometan/Etanol[38]. Mẫu được sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu sữa bột với giá trị hàm lượng chất béo biết trước. Hiệu suất chiết mỡ được đánh giá bằng cách so sánh với hàm lượng chất béo tham khảo.
Hàm lượng mỡ trong mẫu được xác định bằng phương pháp trọng lượng với các bước như sau: Dịch chiết mẫu sau khi được thu vào bình cầu đã cân trước khối lượng (m0) được cơ đuổi dung môi đến khối lượng không đổi (m1). Khối lượng mỡ thu được là khối lượng chất rắn cịn lại trong bình cầu. Hàm lượng mỡ trong mẫu được tính theo cơng thức tính tốn như sau:
% mỡ 1 0 100
m m m
(1) Trong đó m: khối lượng mẫu đem chiết.
2.5.2. Quy trình chiết mẫu
Khoảng 5 g mẫu sữa bột được cân vào cốc thủy tinh 250 mL và trộn với muối Na2SO4 khan đến khi tạo thành hỗn hợp mịn, đồng nhất. Sau đó, 100 µL dung dịch nội chuẩn được thêm vào hỗn hợp ở trên và toàn bộ hỗn hợp này được chuyển vào ống chiết mẫu, để cân bằng trong khoảng 30 phút. Mẫu được chiết trên thiết bị PLE với điều kiện tiến hành chiết mẫu trong bảng 2.5. Dịch chiết mẫu được thu vào bình cầu 250 mL và được cô cạn dung môi trên thiết bị cô cất chân khơng. Hàm lượng Dioxin trong mẫu được tính tốn dựa trên hàm lượng mỡ thu được.
Bảng 2.5: Điều kiện chiết mẫu trên thiết bị chiết lỏng - rắn áp cao
Thơng số Gía trị
Thể tích dung mơi chiết/mẫu 100 mL
Nhiệt độ chiết 120 oC
Áp suất chiết 1700 psi
Thời gian chiết 1 h
2.5.3. Quy trình làm sạch
Sau khi tính tốn hàm lượng mỡ, chất trong bình cầu được hòa tan bằng khoảng 5 mL Hexan để tiến hành làm sạch qua cột. Các cột làm sạch được chuẩn bị bằng cách hoạt hóa cột Silica gel đa lớp bằng 200 mL dung mơi Hexan và hoạt hóa cột Cacbon hai lớp bằng 40 mL Toluen và 100 mL Hexan. Hai cột sau khi đã hoạt hóa được ghép nối với nhau (cột Cacbon ở dưới), mẫu được đưa lên đầu cột Silicagel.
Mẫu được rửa giải qua cột Silicagel bằng 100 mL dung môi Hexan, loại bỏ dung mơi qua cột. Sau đó tháo bỏ cột Cacbon và tiến hành rửa giải qua cột Cacbon hoạt tính bằng 100 mL Toluen, thu dung mơi trong bình cầu 250 mL. Dịch làm sạch được tiến hành cô đuổi dung mơi trên thiết cơ quay chân khơng, và dịng khí N2 về thể tích 20 µL để tiến hành bơm trên thiết bị phân tích. Trước khi phân tích trên thiết bị HRGC/HRMS tiến hành thêm 50 µL dung dịch chất chuẩn thu hồi vào dịch làm sạch.
2.5.4. Điều kiện phân tích trên thiết bị HRGC/HRMS
Các điều kiện tách và phân tích các chất PCDD/Fs được tóm tắt trong bảng 2.6. Bảng 2.6: Điều kiện tách và phân tích các chất Dioxin
TT Thông số Giá trị Cổng nạp mẫu
Nhiệt độ 290 oC
Chế độ bơm Khơng chia dịng
Thể tích bơm mẫu 2 µL Interface Nhiệt độ 290 oC Khí mang Loại khí mang He Lưu lượng dịng khí 1,3 mL/phút Cột tách Loại cột HP-5MS
Kích thước cột Chiều dài: 60 m × Đường kính trong: 0,25 mm, độ dày màng pha tĩnh: 0,25 µm Chương trình nhiệt độ
1200C giữ trong 1,5’, tăng 40oC/phút đến 210oC giữ trong 5’, tăng 2,5 oC/phút đến 270 oC, tăng 20oC/phút đến 320 oC, giữ ở 320oC đến khi kết thúc
Thời gian phân tích 60 phút
Detector
Độ phân giải 10000
Chế độ quét SIM - lựa chọn ion đối với các ion đặc trưng
Năng lượng ion hóa 43 eV
Cường độ dịng nguồn 0,3 – 0,9 mA Nhiệt độ nguồn ion 260 oC
2.5.5. Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích
Sử dụng hệ dung mơi với tỉ lệ thể tích đã khảo sát trong bước 2.5.1, chúng tơi tiến hành chiết lặp 06 mẫu sữa bột. Độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi trung bình của chất chuẩn trong nền mẫu giả và độ lệch chuẩn tương đối.
2.5.6. Phân tích mẫu sữa thu thập tại Đà Nẵng
Sau khi xác nhận phương pháp đảm bảo yêu cầu về độ đúng (đánh giá thông qua độ thu hồi chất chuẩn) và độ chụm (độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối của mẫu lặp),chúng tơi áp dụng quy trình vào phân tích 27 mẫu sữa mẹ. Các chất phân tích được định lượng trên thiết bị HRGC/HRMS bằng phương pháp nội chuẩn và pha lỗng đồng vị. Quy trình phân tích mẫu được tóm tắt trong hình 2.2
Hình 2.2: Quy trình phân tích mẫu sữa sử dụng thiết bị HRGC/HRMS
2.5.7. Tính tốn và đánh giá kết qủa phân tích
Hiệu suất thu hồi của chất nội chuẩn và chất chuẩn làm sạch
Hiệu suất thu hồi của chất chuẩn được tính theo cơng thức sau: 100 vao chat them do Nong duoc phan tich chat do Nong R (2)
Hàm lượng PCDD/Fs trong mẫu được tính theo cơng thức sau: m b V C m C % 100 (3)
Trong đó: C: nồng độ chất phân tích trong dịch bơm phân tích (pg/ µL) Cm: hàm lượng chất phân tích trong mẫu (pg/g mỡ)
V: thể tích dịch mẫu sau khi cơ N2 chuẩn bị bơm phân tích m: Khối lượng mẫu chiết (g)