CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Đánh giá một số tính chất & hoạt tính probiotic của các chủng
được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro
2.2.2.1. Khả năng sinh trưởng
Chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng được nuôi lắc trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vịng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa mơi trường MRS lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,2) và tiếp tục nuôi lắc. Đo mật độ vi khuẩn ở mỗi mẫu bằng máy đo quang phổ ở OD620 và vẽ đường cong sinh trưởng tại các mốc thời gian [8].
2.2.2.2. Khả năng sinh axit lactic
Thí nghiệm này được thực hiện song song với thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng. Sau khi tiếp giống, chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng tiếp tục được nuôi lắc ở 37oC ở 200 vịng/ phút trong mơi trường MRS chuẩn pH 6,5. Tại mỗi mốc thời gian, hút ra 10 mL dịch nuôi lắc, ly tâm và cho vào cốc thủy tinh, bổ sung thêm 20 mL nước cất và 1-2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90o). Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích dung dịch NaOH đã dùng để chuẩn độ [68]. Độ axit tính theo độ Therner: oT = VNaOH tiêu tốn x 10, % axit lactic = oT x 0,009; trong đó: oT là độ Therner, 1oT tương ứng với 9 mg axit lactic.
2.2.2.3. Khả năng chịu muối mật
Dựa theo phương pháp của Todorov và đồng tác giả (2011); Colombo và đồng tác giả (2018), phương pháp thử khả năng chịu muối mật của chủng tuyển chọn được thực hiện như sau: Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vịng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa mơi trường muối mật 0,3% và 3,0% lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,3) và tiếp tục nuôi lắc với điều kiện như trên. Chủng vi khuẩn nuôi trong môi trường MRS không chứa muối mật được dùng làm đối chứng. Đo OD620 lúc 0 giờ và sau 4 giờ nuôi lắc
ở 37oC để xác định khả năng chịu muối mật của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [97], [26].
2.2.2.4. Khả năng chịu axit
Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vịng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang các bình chứa mơi trường MRS đã chuẩn pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và 6 (chuẩn pH bằng dung dịch HCl 1M) sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,2) và tiếp tục nuôi lắc với điều kiện như trên. Đo OD620 tại 0 giờ và sau 3 giờ để xác định khả năng chịu axit của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [97], [26].
2.2.2.5. Khả năng sinh H2O2
Chủng tuyển chọn và chủng đối chứng được nuôi cấy trong môi trường thạch MRS có bổ sung thêm 250 µg/mL 3-3’-5-5’ tetramethylbenzidine và 0,01 mg/mL horse radish peroxidase. Quan sát cường độ màu được phân loại giúp xác định khả năng sinh H2O2 [19].
2.2.2.6. Khả năng nhạy cảm với kháng sinh
Các kháng sinh được sử dụng là (C) Chloramphenicol 30 µg, (E) Erythromycin 15 µg, (TE) Tetracycline 30 µg, (CTX) Cefotaxine 30 µg, (AMP) Ampicillin 10 µg, (CN) Gentamicin 10 µg, (CIP) Ciprofloxacin 5 µg. Sử dụng khoanh giấy kháng sinh đặt trên môi trường đã cấy trải các chủng vi khuẩn nghiên cứu, đường kính vịng ức chế được đo sau khi ủ đĩa ở 37oC trong 48 giờ dưới điều kiện kị khí [107], [106].
2.2.2.7. Khả năng tạo màng biofilm
Trong mơi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện ni cấy tĩnh, một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể.
Việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% được thực hiện như sau: khuẩn lạc các chủng vi sinh vật tuyển chọn được ni cấy kích hoạt trong bình tam giác chứa 10 mL mơi trường MRS lỏng trong 24 giờ ở 37oC trong điều kiện kị khí và chỉnh mật độ tế bào OD620 khoảng ~ 0,6. Hút 100 L dịch nuôi cấy vi khuẩn đã nuôi lắc bổ sung vào 700 L môi trường MRS lỏng trong các ống eppendorf (2 mL hoặc 1,5 mL) đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, dịch ni cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống
trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở OD620 trong dịch nuôi cấy vi khuẩn [72].
Quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật theo phương pháp sau: mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung thêm 1 mL dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh. Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hịa tan trong 1 mL ethanol 70o. Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo OD620 [65].
2.2.2.8. Khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nấm có hại