Mục đích thực hiện được tiêu bản nén tạm thời để quan sát tế bào ở các giai đoạn khác nhau quả quá trình hình thành hạt phấn ở thực vật. Thực hành một số phương pháp xác định độ hữu dục và sức sống hạt phấn của một số loại cây trồng. Phân biệt được hạt phấn bất dục và hạt phấn hữu dục, xác định tỷ lệ hạt phấn hữu dục.
4.1. ĐẶC ĐIỂM, SỨC SỐNG VÀ SỰ NẢY MẦM CỦA HẠT PHẤN 4.1.1. Đặc điểm của hạt phấn 4.1.1. Đặc điểm của hạt phấn
Ở thực vật có hoa, hạt phấn đƣợc hình thành bên trong túi phấn. Hạt phấn có 2 lớp vách tế bào giàu xenlulozơ (cellulose) và trên bề mặt có nhiều loại protein giúp hạt phấn rơi trên đầu nhụy thích hợp, nhân sinh dƣỡng sẽ nảy mầm và tạo ống phấn để chuyển các nhân sinh dục đến nơi nhận ở bầu noãn là túi phôi bên trong tiểu noãn.
Cấu trúc hạt phấn rất đa dạng về hình dạng, kích thƣớc và đặc điểm bề mặt (Hình 4.1). Hạt phấn thƣờng hình cầu, hình bầu dục, hoặc hình kéo dài, cũng có khi có thùy hoặc nhiều góc... Hạt phấn hay đƣợc sắp xếp ở dạng bốn mặt hay tạo thành hình vuông, hình thoi bên trong bao phấn. Thƣờng phát tán thành từng hạt phấn một hoặc thành từng nhóm dính nhau; cũng có khi dính thành bốn hạt nhƣ ở cỏ nến (Typha), cỏ bắt ruồi (họ
Droseraceae), và một số hoa cánh hợp khác. Hạt phấn có khi dính nhau thành phấn khối, là đặc điểm của các họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Lan (Orchidaceae).
Hình 4.1. Đặc điểm bề mặt của một số loại hạt phấn
Hạt phấn hoa có thể nhỏ chỉ vài micromet – μ (Myosotis) hay to đến 0,2 mm ở họ Bầu bí (Cucurbitaceae), họ Gừng (Zingiberaceae), họ Chuối (Musaceae)… Hạt phấn ở Zostera có thể dài đến 2 mm. Bên ngoài hạt phấn có thể trơn, có vân, có vẩy, có nếp nhăn lồi lõm hay có nhiều gai. Trên màng ngoài thƣờng có cấu tạo lỗ. Số lỗ trên hạt phấn nhiều hay ít tùy thuộc loài thực vật.
Cấu trúc bề mặt của hạt phấn cũng liên quan đến khả năng nảy mầm của hạt phấn. Nếu thích hợp, khả năng hấp thụ nƣớc nhanh hơn đồng nghĩa với tạo thành ống phấn nhanh chóng. Điều đó đóng vai trò rất quan trọng đối với sự thụ tinh.
4.1.2. Sức sống và sự nảy mầm của hạt phấn
Xác định sức sống của phôi và của hạt phấn là những vấn đề quan trọng và cần thiết cho ngành nông nghiệp. Vì biết đƣợc sức sống của phôi sẽ dễ dàng xác định sức sống nảy mầm của hạt giống, xác định tỷ lệ nảy mầm của giống đem gieo.
Xác định đƣợc sức sống của hạt phấn giúp chúng ta biết đƣợc khả năng kết hạt của thực vật, những hiện tƣợng không thụ tinh bằng cách thụ phấn nhân tạo, bổ sung thêm cho cây những hạt phấn tốt hơn. Đồng thời xác định đƣợc tỷ lệ bất dục và hữu dục của các cây lai một cách dễ dàng.
Sự nảy mầm của hạt phấn và phát triển ống phấn ở vòi nhụy phụ thuộc và độ hữu dục của hạt phấn (tích lũy dinh dƣỡng), bên cạnh đó còn chịu nhiều tác động của các yếu tố môi trƣờng, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ (ví dụ, ở lúa khi nhiệt độ ở dƣới 15˚C, hạt phấn không nảy mầm đƣợc). Ngoài ra, sự phát triển ống phấn để đƣa tinh trùng vào túi phôi còn chịu sự kiểm tra di truyền, nhƣ hiện tƣợng tự bất hợp (Nguyễn Hồng Minh, 1999).
Sự phát triển ống phấn có thể dễ dàng đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học bình thƣờng nếu bảo đảm chọn đúng giai đoạn mẫu và xử lý nhuộm đúng yêu cầu. Trong tự nhiên, sự phát triển ống phấn thƣờng nhanh hơn trong điều kiện thí nghiệm bởi vì trên đầu nhụy có nhiều yếu tố cần thiết giúp thúc đẩy sự hình thành ống phấn hơn, ví dụ nhƣ các loại khoáng calcium, boron và đƣờng sucrose. Đƣờng sucrose là nguồn cung cấp carbon và còn có ảnh hƣởng thẩm thấu cho ống phấn. Một số loài còn tạo ra flavinol rất cần thiết cho sự sinh trƣởng ở cả hạt phấn lẫn túi phấn. Flavinol duy trì khả năng phát triển của hạt phấn và sự thụ tinh của noãn cầu (trứng). Nghiên cứu cho thấy nếu cây ngô bị đột biến không tạo ra đƣợc enzyme tổng hợp flavinol thì cây ngô trở nên bất dục.
Những hạt phấn phát triển không hoàn chỉnh hay hạt phấn bất dục sẽ có hình dạng không bình thƣờng hoặc chỉ có một nhân. Hạt phấn phát triển bình thƣờng sẽ cho hình dạng đặc trƣng của từng loài. Tuy nhiên, dựa vào hình thái hạt phấn cũng không thể đánh giá chính xác mức độ hữu dục của hạt phấn mà phải sử dụng thêm các phƣơng pháp thử khác.
4.2. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỨC SỐNG CỦA PHÔI VÀ CỦA HẠT PHẤN
Trong việc nghiên cứu tế bào thƣờng ứng dụng nhiều phƣơng pháp nghiên cứu sinh lý tế bào rất đơn giản và nhanh chóng, mất ít thời gian, dễ làm, lại cho kết quả
tƣơng đối chính xác. Những phƣơng pháp này đƣợc dùng nhiều nhất trong việc xác định sức sống của phôi trong hạt, sức sống, sức nảy mầm của hạt phấn, sự khác nhau về trạng thái sinh lý, sinh hóa học của hạt phấn, ống phấn và vòi nhụy…
Những phƣơng pháp này dựa trên cơ sở biến đổi hóa học của các chất trong tế bào để xác định tính chất sinh lý tế bào. Dƣới đây trình bày một vài phƣơng pháp đơn giản và thông dụng nhất.
4.2.1. Phƣơng pháp xác định sức sống của phôi
4.2.1.1. Vật liệu
Hạt thầu dầu, hạt đậu đã ngâm cho trƣơng lên (để dễ cắt), hạt lạc… muối Mohr (là muối kép của sắt (II) và amoni sulfat, có công thức FeSO4.(NH4)2SO4.6H2O; là những tinh thể đơn tà, trong suốt, màu xanh lục; tan nhiều trong nƣớc, FeSO4 trong dung dịch ít nhạy cảm với tác dụng của oxi trong không khí), axit sulfuric đậm đặc.
4.2.1.2. Các bước tiến hành
Hòa 1 hỗn hợp muối Mohr với axit sulfuric đậm đặc theo tỷ lệ với thể tích là 1:1. Sau mắt hạt (phần có chứa phôi) lấy một lát mỏng bỏ vào giọt hỗn hợp trên để một lúc lâu nếu phôi còn có sức sống thì sẽ cho màu đỏ, nếu không còn sức sống thì sẽ cho màu vàng. Sở dĩ có hiện tƣợng đó là vì phôi hay mầm hạt, nếu còn sức sống thì phải chứa men heteroausin. Loại men này khi gặp loại thuốc thử trên sẽ cho phản ứng có màu đỏ. Vì vậy, nếu phôi có sức sống càng cao (nghĩa là càng có nhiều men heteroausin) càng cho màu đỏ thẫm hơn.
4.2.1.3. Yêu cầu đối với sinh viên
Thấy sự khác nhau về phản ứng biểu hiện màu sắc giữa phôi có sức sống và phôi không có sức sống. Từ đó ứng dụng phƣơng pháp này để tính tỷ lệ nảy mầm của hạt giống trong nông nghiệp.
4.2.2. Quan sát hình thái hạt phấn và xác định độ hữu dục của hạt phấn
Để quan sát đầy đủ và chính xác các giai đoạn phát triển của hạt phấn cần phải chọn lựa hoa ở các giai đoạn khác nhau. Có thể quan sát hình thái và xác định độ hữu dục của hạt phấn bằng cách nhuộm màu bởi dung dịch thuốc nhuộm KI (1%) hoặc thuốc axeto cacmin.
4.2.2.1. Quan sát hình thái và xác định độ hữu dục của hạt phấn bằng dung dịch KI (1%)
Ở một số cây trồng, hạt phấn của chúng có lớp vỏ ngoài dày, rất khó quan sát đƣợc tinh tử khi nhuộm màu bằng axeto cacmin. Vì vậy thƣờng dùng phương pháp iot
để xác định độ hữu dục của hạt phấn. Bản chất của phƣơng pháp này dựa vào hàm lƣợng tinh bột trong hạt phấn nhờ phản ứng với dung dịch muối iốt. Độ hữu dục và bất dục của hạt phấn dựa vào sự chứa hàm lƣợng tinh bột. Thƣờng thì hạt phấn hữu dục sẽ
chứa đầy tinh bột, khi phản ứng với dụng dịch muối iốt sẽ cho màu xanh, còn hạt phấn bất dục sẽ chứa ít hoặc không có tinh bột, hạt phấn ít hoặc không có màu xanh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phƣơng pháp điều chế KI (1%): Cân 2 g iốt tinh thể, hòa tan tinh thể trong 5ml nƣớc nóng. Sau khi iốt tan hết, định mức dung dịch lên thể tích 300 ml và cho 1 g KI. Dung dịch này dễ bay màu nên cần phải giữ trong lọ có màu tối.
Các bước tiến hành: Phấn hoa thu nhận từ mẫu tƣơi ở các giai đoạn khác nhau (từ lúc mới thành nụ và khi hoa nở) đƣợc nhuộm bằng dung dịch KI (1%) nói trên. Sau đó quan sát dƣới kính hiển vi, từ đó xác định hạt phấn hữu dục và bất dục. Tính tỷ lệ hạt phấn hữu dục.
4.2.2.2. Quan sát hình thái và xác định độ hữu dục của hạt phấn bằng axeto cacmin
Khi nhuộm hạt phấn chín bằng axeto cacmin, có thể quan sát thấy các nhân sinh dƣỡng và nhân sinh dục trong hạt phấn. Thông thƣờng các nhân này đƣợc nhuộm màu đỏ nâu khác với tế bào chất có màu đỏ nhạt hoặc màu hồng. Ở cây ngô, hạt phấn có hình tròn, có thể thấy rõ hai nhân sinh dục và một nhân sinh dƣỡng, và một lỗ nhỏ nơi ống phấn sẽ phát triển.
A) (B)
Hình 4.2. Hạt phấn ngô sau khi nhuộm màu bằng axeto cacmin
A – hạt phấn hữu dục, 1 – tinh tử; B – hạt phấn bất dục, 1 – hạt phấn bị tách vỏ, 2 – nhân sinh dưỡng và nhân sinh sản bị chết
Các bước tiến hành: Thu thập phấn hoa tƣơi từ cây ở các giai đoạn phát triển khác nhau (từ lúc mới hình thành nụ và khi hoa nở). Sau đó chọn bao phấn đƣa lên lam kính và dùng kim mũi mác cán cho vỡ bao phấn để hạt phấn bung ra. Nhỏ một giọt axeto cacmin để nhuộm màu. Chú ý các bao phấn ở các thời kỳ phát triển khác nhau đƣợc thực hiện riêng để dễ phân biệt.
Quan sát dƣới kính hiển vi và đếm số hạt phấn hữu dục và bất dục, tính tỉ lệ hạt phấn hữu thụ để đánh giá sức sống hạt phấn trong mẫu đã thực hiện.
4.2.3. Phƣơng pháp xác định sức sống của hạt phấn
Sức sống của hạt phấn có thể xác định bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau, có thể dùng các thuốc thử hóa học để gây phản ứng mẫu với các loại enzym có trong hạt phấn
hay xác định dựa vào tính chất của nguyên sinh chất tế bào, hoặc cũng có thể thử bằng cách gieo hạt phấn ngay trong môi trƣờng nhân tạo.
4.2.3.1. Dựa vào phản ứng với các loại enzym có trong hạt phấn
a. Phương pháp B. X. Sadarcov (Пухальский và cs., 2007)
Phƣơng pháp này thực hiện dựa trên cơ sở lý luận là trong hạt phấn sống (hạt phấn có sức nảy mầm) có chứa nhiều enzym peroxidase. Loại enzym này nếu tác dụng với thuốc thử benzidin sẽ cho màu đỏ. Vậy nếu khi cho hạt phấn vào dung dịch benzidin hạt phấn có màu đỏ thì có thể kết luận là hạt phấn này có sức sống, màu đỏ nhạt hay đậm là sức sống mạnh hay yếu. Nếu sau khi bỏ vào dung dịch benzidin hạt phấn vẫn không cho màu đỏ có nghĩa là hạt phấn ấy đã mất sức sống.
Quá trình thực hiện: Điều chế riêng 4 loại dung dịch sau: + 0,2 g benzidin trong 100 ml cồn 50o.
+ 0,15 g α–naftol trong 100 ml cồn 50o. + 0,25 g Na2CO3 trong 100 ml nƣớc cất. + Dung dịch 0,5 % H2O2.
Ba dung dịch đầu hòa lẫn vào nhau theo tỷ lệ 1:1:1 về thể tích. Lấy 1 giọt hỗn hợp này cho lên lam kính, bỏ phấn hoa vào giọt thuốc thử này sau đó nhỏ thêm lên đấy 1 giọt dung dịch H2O2 0,5%. Đƣa lên kính hiển vi để quan sát. Những hạt phấn nào cho màu hồng là hạt phấn sống, hạt phấn không cho màu là hạt phấn đã bị chết.
b. Phương pháp P. I. Diaconu (Пухальский và cs., 2007)
Sự hô hấp của tế bào liên quan chặt chẽ với quá trình sống và tồn tại của enzym dehydrogenase. Khi quá trình hô hấp ngừng sẽ dẫn tới tế bào bị chết và enzyme này sẽ không đƣợc tổng hợp. Trong số các enzym hô hấp có thể dễ dàng xác định sự thay đổi hoạt động của enzym succinate dehydrogenase (nằm bên trong màng của ty thể) với sự trợ giúp của dung dịch không màu triphenyltetrazolium clorua (2,3,5 – triphenyltetrazolium clorua, viết tắt là TTC). Khi có mặt của enzym succinate dehydrogenase thì dung dịch triphenyltetrazolium clorua sẽ chuyển thành một dạng thuốc nhuộm (formazan), tế bào sẽ có màu đỏ. Trong trƣờng hợp quá trình sống bị ngừng, sẽ không diễn ra sự chuyển thành thuốc nhuộm và dung dịch không có màu.
Quá trình thực hiện nhƣ sau:
– Chuẩn bị 0,5 hoặc 1% dung dịch TTC vào 1/15 M dung dịch đệm phosphate Xerenxen với pH = 7,17 (xem mục II.2.3.2);
– Mang hạt phấn lên lam kính và nhỏ 1–2 giọt dung dịch TTC;
– Đậy lamen và đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC khoảng 20 – 30 phút;
– Quan sát dƣới kính hiển vi khoảng 3 – 5 tiêu bản với 5 trƣờng quan sát khác nhau của mỗi tiêu bản và tính tỷ kệ hạt phấn nhuộm màu trên tổng số hạt phấn quan sát ở các trƣờng quan sát.
Hạt phấn có màu đỏ là hạt phấn có sức sống, hạt phấn chết sẽ không bắt màu và có màu vàng.
Phƣơng pháp P. I. Diaconu đã đƣợc nghiên cứu và đƣa ra ở Đại học Nông nghiệp quốc gia Nga, và đƣợc đánh giá là một trong những phƣơng pháp tốt nhất khi nghiên cứu về sức sống hạt phấn của nhiều đối tƣợng cây trồng khác nhau.
4.2.3.2. Dựa vào tính chất của nguyên sinh chất tế bào (Phương pháp B. A. Iursep)
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc thẩm thấu chọn lọc, nguyên sinh chất của tế bào sống có khả năng hấp thụ có chọn lọc đối với các chất khác, còn nguyên sinh chất của tế bào chết không có khả năng này. Vì vậy tế bào sống thƣờng không hấp thụ các loại thuốc nhuộm màu, còn tế bào chết lại nhuộm rất nhiều. Dùng phƣơng pháp này để xác định sức sống của hạt phấn rất tốt, nhất là đối với những hạt phấn không nảy mầm đƣợc trong môi trƣờng nhân tạo (Пухальский và cs., 2007).
– Quá trình thực hiện cần điều chế 2 dung dịch: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Dung dịch erytrozin trong nƣớc, nồng độ 1/5000.
+ Dung dịch đệm phosphate Sorensen với pH = 7,17 hay 7,38. – Điều chế dung dịch đệm phosphate Sorensen nhƣ sau:
Để điều chế 10 ml dung dịch đệm phosphate Sorensen có nồng độ pH = 7,17 cần lấy dung dịch 1/15 Na2HPO4.2H2O thêm vào 3 ml dung dịch 1/15 KH2PO4.
Muốn điều chế dung dịch đệm phosphate Sorensen có nồng độ pH = 7,38 thì lấy hỗn hợp của 2 dung dịch trên với tỷ lệ tính theo thể tích là 8:2.
Trên kính lam nhỏ 1 giọt dung dịch đệm, trộn phấn hoa tƣơi vào đấy. Sau đó nhỏ thêm 1 giọt dung dịch erytrozin mới điều chế vào. Lấy đũa thủy tinh trộn đều để nhƣ vậy khoảng từ 2 đến 5 phút thì đậy lamen lại. Để thêm 5 phút nữa (không để quá 15 – 20 phút).
Tính tỷ lệ hạt phấn không nhuộm màu trên toàn bộ phận sẽ có tỷ lệ hạt phấn không có sức sống.
4.2.3.3. Phương pháp thử nảy mầm hạt phấn trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo
a. Phương pháp buồng ẩm Van – Tigem (Пухальский và cs., 2007)
Buồng ẩm Van–Tigem có cấu tạo gồm một ống hình trụ tròn bằng thủy tinh có đƣờng kính 12 – 15 mm, chiều cao 6 – 8 mm và dày 1,5 – 2 mm. Cả hai đầu trên và dƣới của ống này đều phẳng, một đầu đƣợc gắn vào giữa lam kính bởi vazơlin hoặc parafin, đầu còn lại (phía trên) đƣợc đẩy bởi lamen. Dƣới đáy của ống hình trụ nhỏ 1 giọt nƣớc, còn mặt dƣới của lamen nhỏ 1 giọt dung dịch môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo (hình 4.3). Lamen đậy cũng đƣợc gắn với ống hình trụ bởi vazơlin. Nếu không có ống hình trụ bằng thủy tinh có thể sử dụng ống làm bằng giấy với nhiều lớp, các lớp này đƣợc gắn với nhau bởi parafin.
Hình 4.3. Buồng ẩm Van–Tigem để cấy phấn
Nguồn: Пухальский et al., 2007
Để chuẩn bị môi trƣờng dinh dƣỡng cấy phấn cần điều chế dung dịch agar 1% trong nƣớc đƣờng 5 – 40%, nồng độ đƣờng phụ thuộc vào tính chất của từng loại phấn (ví dụ đối với đậu Hà Lan, ngô, khoai tây và một số cây khác là 10 – 15%). Để điều chế dung dịch này, ngâm 1 g agar trong 100 ml nƣớc cất để agar trƣơng lên. Sau đó đun sôi cho đến khi agar hòa tan toàn bộ trong nƣớc, bỏ thêm vào dung dịch đang sôi 10 – 20 g đƣờng glucose hay sacarose, khuấy đều cho đến khi đƣờng tan hết. Đôi khi cho thêm dung dịch 0,008% axit boric (H3BO3).