Kích thước mỗi bể: dài x r ng x cao = 40 x 25 x 30 (cm), được làm bằng kính
dày 5 mm, quá trình vận hành luôn được sục khí liên tục 24 giờ.
CP1 CP2 CP3
26
2.3Phương pháp nghiên cứu
2.3.1Phương pháp thu mẫu
- Mẫu bùn: mỗi ao nước th i thu 1 mẫu bùn đáy kho ng 100 g/mẫu.
- Mẫu nước: nước được thu cách mặt nước 20 - 30 cm, l y kho ng 500 ml/mẫu
nước.
- Mẫu tôm: dùng vợt để bắt tôm trong ao, chọn 2 – 3 con tôm khỏe mạnh cho vào
túi nilon sạch đã được khử trùng.
Sau khi thu, t t c các mẫu trong 10 ao nước th i được b o qu n lạnh trong
suốt thời gian vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm tại thành phố H Chí Minh
trong vòng 24 giờ.
2.3.2Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu trước khi phân lập được xử lý theo các bước như sau:
- Mẫu bùn: cân 1,0 g đ t và pha loãng trong 9,0 ml nước muối sinh lý vô trùng,
để lắng và thu 1,0 ml phần nước nổi và pha loãng đến 10-5.
- Mẫu nước: lắc đều và hút 100 µl pha trong 900 µl nước muối sinh lý vô trùng
và pha loãng đến 10-3.
- Mẫu dịch tiêu hóa tôm: được rửa sạch bằng dung dịch nước muối sinh lý vô
trùng, dùng dao chuyên dụng mổ và l y ống tiêu hóa (ru t và dạ dày). Ống tiêu hóa được nghiền trong eppendorf 2,0 ml bằng chày sứ nhỏ chuyên dụng. Dịch sau khi nghiền được hòa trong 1,0 ml dung dịch nước muối sinh lý và pha loãng đến 10-5.
2.3.3Các phương pháp phân tích chỉ tiêu nước
pH
Áp dụng TCVN 6492:2011 (ISO 10523:2008) - Ch t lượng nước- Xác định pH.
Cho mẫu nước vào m t cốc thuỷ tinh trung tính khô và sạch.
27
nước c t, làm khô điện cực nhúng vào nước thử và đọc kết qu trên thang pH giá trị pH đo được là trung bình c ng của 3 lần xác định trên cùng m t mẫu.
Phương pháp phân tích COD trong nước th i
Áp dụng TCVN 6491:1999 (ISO 6060:1989) Ch t lượng nước – xác định nhu cầu
ôxy hóa học (COD). Chỉ tiêu COD trong nước th i được phân tích bằng cách cho
mẫu nước đun h i lưu với kalibicromat K2Cr2O7 với ch t xúc tác là bạc sunfat
Ag2SO4 trong môi trường acid H2SO4đặc ở nhiệt đ 150oC trong 2 giờ. Hầu hết
các ch t hữu cơ đều bị phân hủy trong môi trường này, lượng K2Cr2O7 và
H2SO4sẽ gi m tương ứng với lượng ch t hữu cơ có trong mẫu. Để biết lượng
ch t hữu cơ có trong mẫu ta tiến hành định phân lượng K2Cr2O7 dư bằng
Fe(NH4)2(SO4)2 (FAS).
COD (mgO2/l) = (1)
Trong đó: A: Thể tích FAS dùng cho ống thử không; B: Thể tích FAS dùng cho ống thử thật;
M: Nguyên chuẩn đ của FAS (hệ số xác định sự chênh lệch giữa n ng đ thực
của FAS lúc mới pha so với n ng đ FAS đã bị biến đổi khi để lâu ngoài không
khí).
Phương pháp phân tích hàm lượng nitrogen – ammonia (NH4+) trong nước
th i
Áp dụng TCVN 6179-1:1996 (ISO 7150-1:1984) - Ch t lượng nước – Xác
định amoni phần 1: Phương pháp trắc phổ thao tác bằng tay. Chỉ tiêu NH4+ được
phân tích bằng phương pháp Nessler hóa trực tiếp, khi cho nước th i chứa NH4+
ph n ứng với thuốc thử Nessler trong môi trường kiềm sẽ cho s n phẩm có màu
vàng. Phương trình ph n ứng diễn ra như sau:
2(2KI.HgI2) + NH3+ 3KOH → (NH2)Hg-O-HgI (màu vàng) + 7KI + 2H2O (9)
Sau khi thêm Nessler được 10 phút, tiến hành so màu các dung dịch ở bước sóng 430 nm. Từ đường cong tham chiếu và đ h p thu của mẫu ta tính được hàm
28
lượng NH3trong mẫu ban đầu.
Phương pháp phân tích hàm lượng nitrit (NO2-) trong nước th i
Áp dụng TCVN 6178:1996 (ISO 6777:1984) - Ch t lượng nước - Xác định nitrit.
Phương pháp trắc phổ h p thụ phân tử. Chỉ tiêu NO2- được phân tích bằng
phương pháp so màu, khi cho nước th i chứa NO2-ph n ứng với 4 -aminobenzen
sufonamid với sự có mặt của acid octhophosphoric ở pH bằng 1.9 để tạo muối
diazo, mà muối này sẽ tạo thuốc nhu m màu h ng với N-(1 naphtyl)- 1.2
diamonietan dihidroclorua (được thêm vào bằngthuốc thử 4 - aminobenzen
sufonamid. Đo đ h p thu ở 540 nm. Từ phương trình đường chuẩn và hệ số h p
thu ta tính được n ng đ NO2- trong mẫu.
Phương pháp phân tích hàm lượng nitrogen – nitrat (NO3-) trong nước th i
Áp dụng TCVN 6180:1996 (ISO 7890-3:1988) - Ch t lượng nước - Xác định
nitrat. Phương pháp trắc phổ dùng acid sunfosalixylic. Chỉ tiêu NO3- được phân
tích bằng phương pháp so màu, khi cho nước th i chứa NO3- ph n ứng với acid
sunfosalixylic (được hình thành do việc thêm natri salixylat và acid sunfuric vào
mẫu) và tiếp theo xử lý với kiềm sẽ cho hợp ch t màu vàng. Cường đ màu được
đo ở bước sóng 415 nm. Từ phương trình đường chuẩn và hệ số h p thu ta tính
được n ng đ NO3-trong mẫu.
2.3.4Phương pháp phân lập và làm thuần nhóm vi khuẩn Bacillus
Bacillus là trực khuẩn gram dương, hình thành bào tử, do đó trước khi phân lập,
mẫu được đun ở nhiệt đ cao để loại bỏ tế bào sinh dưỡng chỉ giữ lại những
chủng có sinh bào tử cho các bước chọn lọc làm thuần Bacillus.
Cách tiến hành
Pha loãng mẫu ở các n ng đ (n ng đ tùy theo mẫu nước, bùn hay dịch tiêu
hóa) bằng nước muối sinh lý NaCl (0,9%) đã vô trùng. Loại bỏ bớt các vi khuẩn
khác ngoài vi khuẩn Bacillus, vì vi khuẩn Bacillus có kh năng bằng cách tiến
hành gia nhiệt mẫu trong tủ s y ở nhiệt đ 80°C trong 20- 30 phút. Hút 100µl
dịch đã gia nhiệt ở 3 n ng đ pha loãng tr i trên môi trường LB – agar. Ủ ở 37oC
29
chọn khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng của Bacillus như: tròn, rìa răng cưa
hoặc trơn không đều, màu vàng sám, trắng đục để làm thuần.
Làm thuần:
Bằng cách c y ria khuẩn lạc tuyển chọn trên môi trường LB-agar, lặp lại nhiều
lần cho tới khi quan sát th y chỉ có m t dạng khuẩn lạc duy nh t trên môi trường.
2.3.5Phương pháp phân lập và làm thuần nhóm vi khuẩnnitrit hóa
Cách tiến hành:
Pha loãng mẫu ở các n ng đ (n ng đ tùy theo mẫu nước, bùn hay dịch tiêu
hóa) bằng nước muối sinh lý NaCl (0,9%) đã vô trùng. Hút 100µl dịch ở các
n ng đ pha loãng tr i trên môi trường Winogradsky medium for nitrification
phase 1. Ủ ở 30°C trong điều kiện hiếu khí và bóng tối nhưng thời gian lâu từ 4-7 ngày. (L.O. Odokuma* and E. Akponah, 2008). Quan sát nhóm khuẩn lạc mọc được trên môi trường Winogradsky medium phase 2, lựa chọn khuẩn lạc rời rạc và có sự lập lại tại các n ng đ .
Làm thuần
Bằng cách c y ria khuẩn lạc tuyển chọn trên môi trường Winogradsky medium
for nitrification phase 1, lặp lại nhiều lần cho tới khi quan sát th y chỉ có m t
dạng khuẩn lạc duy nh t trên môi trường.
2.3.6Phương pháp phân lập và làm thuần nhóm vi khuẩnnitrat hóa
Cách tiến hành
Pha loãng mẫu ở các n ng đ (n ng đ tùy theo mẫu nước, bùn hay dịch tiêu
hóa) bằng nước muối sinh lý NaCl (0,9%) đã vô trùng. Hút 100µl dịch ở các n ng đ pha loãng tr i trên môi trường Winogradsky medium phase 2. Ủ ở 30°C
trong điều kiện hiếu khí và bóng tối nhưng thời gian lâu từ 4-7 ngày [63]. Quan
sát nhóm khuẩn lạc mọc được trên môi trường Winogradsky medium phase 2, lựa
30
Làm thuần
Bằng cách c y ria khuẩn lạc tuyển chọn trên môi trường Winogradsky medium phase 2, lặp lại nhiều lần cho tới khi quan sát th y chỉ có m t dạng khuẩn lạc duy
nh t trên môi trường.
2.3.7Phương pháp cấy chuyền và lưu trữ vi khuẩn
Sau khi ủ các đĩa môi trường ở 30°C trong 24 – 28 giờ, khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ phát triển trên bề mặt đĩa thạch. Thực hiện tách ròng từng chủng vi khuẩn bằng phương pháp c y chuyền nhiều lần để thu được từng chủng vi khuẩn thuần. Các chủng này đều được lưu trữ bằng cách l y sinh khối vi khuẩn
cho vào eppendorf chứa 300µl glycerol 15% và đem giữ chủng ở nhiệt đ âm 80oC.
2.3.8Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào
2.3.8.1 Khả năng sinh enzyme amylase Nguyên tắc
M t số vi sinh vật có kh năng tiết ra enzyme amylase có tác dụng phân gi i tinh
b t thành các đường đơn để vi khuẩn dễ sử dụng. Ph n ứng này dễ nhận biết khi
ta nhỏ dung dịch lugol vào môi trường thạch nuôi c y, nếu trong môi trường có tinh b t thì sẽ chuyển sang màu xanh đậm, nếu trong môi trường không còn tinh b t thì lugol không làm chuyển màu môi trường.
Cách tiến hành
Hoạt hóa chủng tuyển chọn Bacillus trên môi trường LB ở 37oC trong 24 giờ.
Dùng tăm c y vô trùng c y chủng tuyển chọn Bacillus tương ứng trên môi trường
thạch dinh dưỡng có bổsung 1% tinh b t tan. Ủ đĩa 37oC trong 24 giờ, nhỏ lugol,
quan sát và ghi nhận kết qu .
2.3.8.2 Khả năng sinh enzymecellulose
Nguyên tắc
31
Dựa vào sự bắt màu đỏ của thuốc nhu m đỏ Congo với CMC để xác định vi
khuẩn có enzyme cellulase hay không. Nếu vi khuẩn có enzyme cellulase phân
cắt CMC thì xung quanh khuẩn lạc có vùng CMC bị phân cắt sẽ xu t hiện vòng
phân gi i.
Cách tiến hành
Hoạt hóa chủng tuyển chọn Bacillus trên môi trường LB ở 37oC trong 24 giờ.
Dùng tăm c y vô trùng c y chủng tuyển chọn trên môi trường thạch dinh dưỡng
bổ sung 0,5% CMC. Ủ đĩa 37oC trong 24 giờ. Nhỏ thuốc nhu m đỏ Congo 1%, quan sát và ghi nhận kết qu .
2.3.8.3Khả năng sinh enzyme caseinase Nguyên tắc
Casein là m t protein sữa khi được phối tr n vào môi trường thạch dinh dưỡng
casein làm môi trường thạch bị đục. Chủng kiểm tra được nuôi trên môi trường
có bổ sung 1% sữa gầy, vi khuẩn có kh năng tiết protease sẽ xu t hiện vòng trong xung quanh khuẩn lạc vì casein bị phân hủy.
Cách tiến hành
Hoạt hóa chủng tuyển chọn Bacillus trên môi trường LB ở 37oC trong 24 giờ.
Dùng tăm c y vô trùng c y chủng tuyển chọn trên môi trường thạch dinh dưỡng
có bổ sung 1% sữa gầy.Ủ đĩa 37oC trong 24 giờ, quan sát và ghi kết qu .
2.3.9Phương pháp xác định khả năng chuyển hóa nitơ
Vi khuẩn nitrit hóa
Quá trình chọn lọc vi khuẩn nitrit hóa là quá trình chọn các chủng vi khuẩn có
kh năng chuyển hóa NH4+ thành NO2- nhanh nh t. Phương pháp tiến hành như
sau: Cân 0,5g NH4Cl hòa tan vào 1.000 mL nước c t, l y 20 mL dung dịch hòa
tan cho vào các ống nghiệm, bổ sung vi khuẩn nitrit hóa vào t t c các ống
nghiệm và m t đối chứng không bổ sung vi khuẩn. Kiểm tra n ng đ NO2- trong
ống nghiệm không bổ sung vi khuẩn và có bổ sung vi khuẩn ở ngày 0, 1, 2, 3, 4,
32
nghiệm tiếp theo.
Vi khuẩn nitrat hóa
Tương tự như quá trình chọn lọc vi khuẩn nitrat hóa, quá trình chọn lọc vi khuẩn
nitrat hóa là quá trình chọn các chủng vi khuẩn có kh năng chuyển hóa NO2- thành NO3- nhanh nh t. Phương pháp tiến hành như sau: Cân 0,5 g KNO3 hòa tan
vào 1.000 mL nước c t, l y 20 mL dung dịch hòa tan cho vào các ống nghiệm, bổ
sung vi khuẩn nitrat hóa vào ống nghiệm, riêng ống nghiệm đối chứng không bổ
sung vi khuẩn. Kiểm tra n ng đ NO3-trong t t c các ống nghiệm ở ngày 0, 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8. Các nghiệm thức có hàm lượng NO3-cao nh t sẽ được chọn bố thí
nghiệm tiếp theo .
2.3.10Định danh vi sinh vật bằng MALDI- TOF
MALDI – TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight)
định danh vi sinh vật bằng d u n phân tử. So sánh sự tương đ ng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của gần 6000 chủng vi sinh vật khác nhau.
Các mẫu vi khuẩn được gửi và định danh đến loài bằng MALDI - TOF tại Công
ty TNHH Dịch Vụ Khoa Học và Công Nghệ Sinh Học LEFAN.
2.3.11Phương pháp xử lý số liệu
Phương pháp định lượng dùng phần mềm Excel để thống kê và xử lý các kết qu
thu được khi tiến hành các thí nghiệm.
2.3.12Phương pháp tạo chế phẩm sinh học xử lý nước thải ao nuôi tôm
Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn có kết qu hoạt tính tốt trên môi trường
LB lỏng (không có agar).
- C y vi khuẩn trong 50 ml môi trường LB lỏng đã tiệt trùng ,lắc 200 vòng/phút
trong 12 giờ ở 37oC.
- C y chuyền sang 450 ml môi trường LB lỏng lắc 200 vòng/phút trong 12 giờ ở
37oC.
33
nhau 1:1:1, 2:1:1 và 3:1:1 tạo thành 3 chế phẩm lỏng (theo thứ tự các chủng
Bacillus cereus : Pseudomonas stuzeri :Bacillus coagulans).
2.4Bố trí thí nghiệm
2.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập các chủng vi khuẩn từ nước ao đang nuôi tôm
Thí nghiệm này sử dụng các phương pháp sau:
- Phương pháp thu mẫu. - Phương pháp xử lý mẫu.
- Phương pháp phân lập và làm thuần.
- Phương pháp c y truyền và lưu trữ vi khuẩn.
Các mẫu bùn, nước và dịch tiêu hóa của tôm được pha loãng đến n ng đ thích hợp r i c y lên 2 môi trường là Winogradsky medium for nitrification phase 1 và 2, ủ ở 30°C trong điều kiện hiếu khí và bóng tối nhưng thời gian lâu từ 4-7 ngày.
Sau đó mẫu pha loãng được gia nhiệt ở tủ s y (80oC) trong 20 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng r i c y lên môi trường LB – agar. Ủ 37oC trong vòng 24 giờ.
Tuyển chọn các khuẩn lạc để c y ria làm thuần. Lưu trữ ở nhiệt đ - 80oC.
2.4.2 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn tiềm năng
2.4.2.1 Tuyển chọn các chủng Bacillus tiềm năng
Thí nghiệm này sử dụng phương pháp xác định kh năng sinh enzyme ngoại bào.
Các enzyme ngoại bào này bao g m: enzyme amylase, enzyme cellulose, enzyme
caseinase. Các chủng vi khuẩn đã được phân lập tuyển chọn từ thí nghiệm 1 sẽ được thử lần lượt kh năng sinh các enzyme ngoại bào trên. Các chủng Bacillus
có kh năng sinh m t trong ba enzyme ngoại bào trên được giữ lại và tiến hành định danh.
2.4.2.2 Tuyển chọn các chủngnhóm nitrat hóa tiềm năng
Vi khuẩn nitrit hóa
Quá trình chọn lọc vi khuẩn nitrit hóa là quá trình chọn các chủng vi khuẩn có kh năng chuyển hóa NH4+ thành NO2- nhanh nh t. Phương pháp tiến hành như
34
sau: Cân 0,5g NH4Cl hòa tan vào 1.000 mL nước c t, l y 20 mL dung dịch hòa tan cho vào các ống nghiệm, bổ sung vi khuẩn vi khuẩn nitrit hóa vào t t c các ống nghiệm và m t đối chứng không bổ sung vi khuẩn. Kiểm tra n ng đ NO2-
trong ống nghiệm không bổ sung vi khuẩn và có bổ sung vi khuẩn ở ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Các nghiệm thức có hàm lượng NO2- cao nh t sẽ được chọn bố trí thí nghiệm.
Vi khuẩn nitrat hóa
Tương tự như quá trình chọn lọc vi khuẩn nitrit hóa , quá trình chọn lọc vi khuẩn
nitrat hóa là quá trình chọn các chủng vi khuẩn ó kh năng chuyển hóa NO2- thành NO3- nhanh nh t. Phương pháp tiến hành như sau: Cân 0,5 g KNO3 hòa tan
vào 1.000 mL nước c t, l y 20 mL dung dịch hòa tan cho vào các ống nghiệm, bổ sung vi khuẩn vi khuẩn nitrat hóa vào ống nghiệm, riêng ống nghiệm đối chứng