Trước khi giải trình tự Sanger các mẫu tách chiết được điện di sản phẩm PCR với cặp mồi miniset PS1 và PS2 trên gel agarose 2% để kiểm tra hiệu quả của quá trình tách chiết.
- + - + - + M M M M PS1 PS2 A B
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi miniset PS1 và PS2 trên gel agarose 2%. - + - + M M M M PS1 PS2 PS1 PS1 PS2 PS2 C D E F
A, B, C, D, E, F lần lượt là các kết quả điện di mtDNA được tách chiết từ mẫu xương K1B10A, K1B07, K1A06, K1B05, K1B08, K1B10. (+): mẫu đối
chứng dương, (-): mẫu đối chứng âm, M: 100 bp DNA marker, PS (PCR primer sets): các cặp mồi sử dụng trong PCR.
Hình ảnh điện di sản phẩm mtDNA đã được tinh sạch cho thấy khả năng tách chiết chiết DNA từ mẫu xương cổ rất kém. Chỉ cĩ 2 mẫu hiện band của DNA tương ứng với PS1 (263bp: mồi xuơi bắt đầu từ mucleotide ở vị trí 15989, mồi ngược bắt đầu từ nucleotide ở vị trí 16251) và PS2 (271bp: mồi xuơi bắt đầu từ mucleotide ở vị trí 15, mồi ngược bắt đầu từ nucleotide ở vị trí 285) của vùng HV1 (342bp: kéo dài từ nucleotide ở vị trí 16024 đến nucleotide ở vị trí 16365) đĩ là mẫu xương K1A06 và mẫu xương K1B05. Đây cũng là hai mẫu cĩ chất lượng tốt nhất. Hai mẫu này được lựa chọn để tiếp tục giải trình tự Sanger. Phân tích trình tự Sanger thu được trên phần mềm Sequencher giúp giảm thiểu các heteroplasmy trên trình tự thuộc vùng HV1. Việc này giúp gia tăng độ chính xác khi đối chiếu lại với trình tự tồn bộ hệ gen ty thể giải trình tự bằng máy giải trình tự thế hệ mới Ion S5™.
Nguyên tắc chung của tách chiết DNA từ bột xương thường bao gồm các bước sau đây: Ủ trong đệm ly giải để phá vỡ cấu trúc mơ và tế bào về mặt hĩa học, tiếp theo là bước ủ trong dung dịch đệm liên kết muối nồng độ cao hỗ trợ liên kết DNA với silica. DNA sau đĩ được rửa bằng dung dịch gốc etanol để giảm thiểu sự mang chất ức chế và rửa giải trong dung dịch đệm muối nồng độ thấp. Phương pháp của Loreille [55] và Dabney [56] là các phương pháp thường được sử dụng để tách chiết mtDNA trong các mẫu cổ đại [57]. Trong những năm gần đây phương pháp của Dabney [56] thường được lựa chọn để sử dụng với các mẫu cĩ tuổi rất cao [58–60]. Kết quả so sánh cho thấy, theo phương pháp Dabney [56] với 50 mg mẫu cho lượng DNA được tách chiết là cao nhất với các mẫu xương cĩ tuổi khác nhau, đặc biệt là mẫu 2000 năm tuổi (0.035 pg/mg). Hàm lượng mẫu 50mg cũng là thơng số được lựa chọn trong quy trình tách chiết của luận văn này. Kit Qiagen EZ1 DNA cũng được lựa chọn để tách chiết mtDNA từ các mẫu bị phá huỷ nặng theo thời gian, đĩ là mẫu từ xương của lính tham gia thế chiến thứ II [61] và mẫu 750 năm tuổi [62]. Mẫu thế chiến thứ II cĩ tuổi cách đây khơng quá xa và khơng phát hiện tổn thương DNA, hiệu suất tách chiết DNA
tốt, mẫu 750 tuổi, theo định lượng Quantifiler Trio DNA, lượng thấp DNA thu được từ răng, trong khi hàm lượng DNA thu được từ xương đủ ngưỡng để kit phát hiện (0.0523 ng/μl và 0.0407 ng/μl lần lượt với mẫu trưởng thành và mẫu thiếu nhi).
Kiểm tra nồng độ DNA đầu vào sử dụng bộ Quantifiler Trio kit (ThermoFisher, USA).
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra nồng độ DNA đầu vào sử dụng bộ Quantifiler Trio kit (ThermoFisher, USA)
Well Sample name Sample type Quantity Quantity Mean (ng/µL) M:F Ratio Mean M:F Ratio Degradation Index Degradation Index Mean G5 Xuong co 1 UnKnown 0,00 0,00 - - - - G6 Xuong co 2 UnKnown 0,00 0,00 - - - -
Kết quả cho thấy mẫu xương khảo cổ dưới ngưỡng định lượng của kit (0.005 ng/uL), do đĩ khơng hiện thơng số với các chỉ số khi kiểm tra nồng độ DNA đầu vào (Bảng 3.1). Sau đĩ, tiến hành định lượng thư viện sau chuẩn bị bằng Ion Library Taqman Quantification kit, kết quả chi tiết tại bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả định lượng thư viện sau chuẩn bị bằng Ion Library Taqman Quantification kit (ThermoFisher, USA)
Well Sample Name Quantity (pM) Target pM Stock(µL) H2O (µL)
F11 Xuong co 1 (Manual) 3612,040527 30 2 238,80 E11 Xuong co 2 (Manual) 3090,441162 30 2 204,03
Các thơng số định lượng thư viện cho thấy thư viện đạt chất lượng để tiến hành giải trình tự.
3.1.2. Kết quả giải trình tự bằng hệ thống máy Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific)
Bảng báo cáo các thơng số giải trình tự cho thấy tổng dung lượng dữ liệu thu được: 147 Mbases. 1.4 triệu read. ISP loading 27% (hình 3.9). Với thơng số này cho thấy lần giải trình tự này chưa khai thác được hết dung lượng của chip giải trình tự. Trong những lần giải trình tự sau này chúng tơi đã giải quyết được khuyết điểm này. Tăng tỉ lệ Loading lên trên 90%.
Biểu đồ độ dài đoạn đọc cho thấy đoạn đọc phân bố chủ yếu từ 50- 150bp. Đoạn đọc trung bình là 86bp rất thích hợp với thiết kế của bộ kit.
Biểu đồ tín hiệu Flows cho thấy peak tín hiệu khoảng 68 (hình 3.9). Hơi thấp so với các mẫu chuẩn là 85. Chứng tỏ chất lượng thư viện của các mẫu xương lâu năm khá là kém.