Hiệu giá kháng thể trung hịa
Huyết thanh kháng các Dịng virus: Dịng virus PEDV PC22A độc lực cao S INDEL Iowa106 S 197 DEL PC 177 CV777 cổ điển PC22A độc lực cao* 1024a 1024 1024 64 S INDEL Iowa106** 16 64a 64 16 S 197 DEL PC 177* 256 256 256a 256 CV777 cổ điển* 512 512 512 512a TGEV dịng Miller ** < 4 < 4 < 4 < 4 TGEV dịng Purdue** < 4 < 4 < 4 < 4
Ghi chú: * Huyết thanh lợn hồi phục, ** huyết thanh lợn tối miễn dịch ( a ) phản ứng đồng chủng
Nghiên cứu của các nhà khoa học về sự biến đổi gen và biến đổi kháng nguyên của các dịng PEDV để từ đĩ kiểm sốt dịch PED nổ ra và để phát triển vắc xin phù hợp. Theo các tài liệu mơ tả trước đây (Rweyemamu & Hingley, 1984; Ngơ Thanh Long & cs., 2016)và tài liệu OIE năm 2009, phương pháp tin
cậy nhất là miễn dịch vắc xin cho bản động vật, sau đĩ cơng thử thách với mỗi chủng virus phân lập khác nhau, sẽ trả lời chính xác hiệu lực và tính kháng chéo tồn diện nhất. Những vấn đề về an tồn, độ lặp lại và tốn kém tài chính, thời gian, nên việc sử dụng thay thể bằng phương pháp huyết thanh học trong phịng thí nghiệm (in vitro) là cần thiết (Lin & cs., 2015).
So sánh miễn dịch chéo là so sánh cặp đơi giữa một huyết thanh miễn dịch của 1 chủng virus phản ứng từng cặp một với các dịng virus khác nhau, sự tương quan huyết thanh học được tính tốn bởi tỉ số r (Ratio serological relatedness)
(Rweyemamu, 1978). r =
Hiệu giá kháng thể trung hịa dị chủng
Hiệu giá kháng thể trung hịa đồng chủng
Một số hạn chế của phản ứng chéo (Chen, 2016): (1) kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cĩ thể cĩ phản ứng nền khơng đặc hiệu bởi động vật thí nghiệm. (2) Huyết thanh miễn dịch mỗi chủng tại thực địa chứa kháng thể đa dịng, cĩ thể huyết thanh phản ứng bởi các epitope khơng phải epitope trung hịa. (3) Khơng bộc lộ kháng thể miễn dịch qua trung gian tế bào của vật chủ với virus.
2.4. TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
Các phản ứng phát hiện kháng thể kháng PEDV trong huyết thanh, trong sữa, trong phân và dịch đường tiêu hĩa gồm cĩ phản ứng phát hiện kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Immunofluorescence assay-IFA), phản ứng trung hịa virus (Virus Neutralisation Test - VNT), phản ứng miễn dịch liên kết enzym
(enzym-linked immunosorbent assay - ELISA). Mỗi phản ứng cĩ ưu điểm riêng
nhằm phát hiện kháng thể. Chúng là các cơng cụ quan trọng để đánh giá phản ứng sinh kháng thể của cơ thể vật chủ sau khi nhiễm PEDV, xác định sự phơi nhiễm PEDV trong đàn, hay dùng đánh giá hiệu quả của vắc xin trong chiến lược dùng vắc xin. Phản ứng huyết thanh học hữu ích trong việc tầm sốt kháng thể mẹ truyền bảo vệ đàn con sơ sinh. Đến nay chỉ xác định được 1 serotype huyết thanh học của PEDV (Lin & cs., 2015; Qi & cs., 2016).
2.4.1. Phản ứng trung hịa virus
Như đã đề cập, protein S coi như là đích kháng nguyên đầu tiên để phát triển vắc xin cĩ hiệu quả chống lại Coronaviruses (Gallagher & Buchmeier, 2001). Một phần glycoprotein S cĩ vai trị bám dính với thụ thể của tế bào vật
chủ, một phần tạo điều kiện dung hợp vỏ virus với lớp màng tế bào vật chủ và cho phép bộ gen của virus xâm nhập vào vật chủ (Yoo & cs., 1991). Protein S chứa epitope trung hịa chính của virus PED (Chang & cs., 2002), Protein S của TGEV cũng tương tự chứa đựng epitope trung hịa (Duarte & cs., 1994).
Phản ứng trung hịa virus được dùng rộng rãi để xác định kháng thể trung
hịa virus PEDV (Okda & cs., 2015). Cơ chế trung hịa virus được xác định như
là sự giảm virus nhiễm bởi sự gắn kết kháng thể với virion, kháng thể trung hịa khĩa một hoặc nhiều giai đoạn khi virus tiếp xúc/xâm nhập với tế bào vật chủ.
Nguồn: Klasse (2014) Ghi chú: Hình trịn màu xanh nam to nhất là mơ hình tế bào vật chủ, kháng thể trung hịa cĩ biểu tượng
hình chữ Y, 6 hình trịn nhỏ là mơ hình virus ở các giai đoạn xâm nhập khác nhau.
Hình 2.11. Cơ chế trung hịa virus của kháng thể trung hịa
Hình trên cho thấy kháng thể trung hịa khĩa lớp vỏ của virus, virus khơng bám dính và khơng thâm nhập được vào tế bào vật chủ. Sự xâm nhập cĩ thể bị khĩa ở các giai đoạn khác nhau. (1) Virion màu xanh da trời bị kháng thể trung hịa gắn tiểu phần của virus làm virus khơng gắn được với thụ thể của tế bào. (2) Virion màu đỏ là virion trần đã xâm nhập được vào nội bào nhưng kháng thể trung hịa đã khĩa vị trí tiếp cận với TRIM21 (TRIM21 màu vàng) vơ hiệu hĩa
enzym , chúng khơng gắn kết được vào hệ gen trong tế bào vật chủ. (3) Virion màu xám là virus trần, kháng thể trung hịa đã khĩa sự xâm nhập vào nội quan của tế bào. Kết quả virus bị ly giải hoặc khơng tổng hợp các tiểu phần virus, bởi vậy kháng thể trung hịa làm giảm sự nhiễm virus vào tế bào (Klasse, 2014).
Về cơ chế trung hịa PEDV, kháng thể trung hịa khĩa vị trí bám của virus
PED vào tế bào vật chủ. Báo cáo trước đây cho biết, sau khi phân lập được kháng thể đơn dịng đặc hiệu PEDV, mẫu kháng thể đơn dịng đã trung hịa virus, kết quả virus khơng bám dính được vào tế bào Vero. Kháng thể trung hịa đã bộc lộ chức năng hồn chỉnh trung hịa virus thơng qua việc khĩa vị trí tiếp cận của PEDV và phịng ngừa sự nhiễm của PEDV vào tế bào. Tác giả cịn cho thấy virus hấp thụ vào tế bào thơng qua màng nội bào trong điều kiện 370Cthì hiệu quả hơn
40C (Gong & cs., 2018).
Đánh giá hiệu giá kháng thể trung hịa bằng cách nhuộm hĩa miễn dịch sẽ nhanh và chính xác hơn là dựa vào vào việc chờ virus gây bệnh tích tế bào (CPE). Kháng thể trung hịa xác định bằng phương pháp nhuộm miễn dịch trong vịng 30 giờ trong khi quan sát virus gây bệnh tích trên tế bào sau khi nhiễm ít nhất 3 ngày. Ngồi ra, việc quan sát PEDV trong phản ứng trung hịa bằng cách nhuộm miễn dịch đặc hiệu cịn cho phép xác định điểm pha lỗng cuối mà ở đĩ giảm 90% số cụm virus nhiễm vào tế bào một cách dễ dàng. Xác định PEDV nhiễm trong tế bào bằng cách nhuộm hĩa miễn dịch (immunocytochemical)
(Paudel & cs., 2014a), hoặc nhuộm miễn dịch huỳnh quang (immunofluorecent) (Joseph & cs., 2015). Trong phản ứng nhuộm miễn dịch cĩ thể dùng kháng thể đa
dịng hoặc đơn dịng kháng PEDV và kháng thể cộng hợp kháng lồi gắn enzyme peroxidase. Cơ chất phát hiện màu là DAB hoặc AEC. Ngồi ra, nhĩm tác giả
(Annamalai & cs., 2017) xác định kháng thể trung hịa bằng cách xác định giảm
số số cụm PFU (PFU- plaque forming unit).
Hiệu giá kháng thể trung hịa được xác định là số đảo ngược của độ pha lỗng cao nhất của mẫu mà làm giảm ít nhất 90% số cụm virus so với đối chứng âm. Mẫu được gọi dương tính khi hiệu giá mẫu ≥1:20 (Okda & cs., 2015; Clement & cs., 2016). Tuy nhiên, một số tác giả lại đánh giá phản ứng trung hịa
dương tính khi số tế bào nhiễm PEDV giảm ít nhất 50% (Paudel & cs., 2014a),
hay giảm 80% (Lin & cs., 2015) so với đối chứng âm thì gọi là dương tính.
Phản ứng trung hịa được tối ưu cho việc định lượng kháng thể trung hịa trong sữa đầu và sữa thường, nĩ quan trọng trong kiểm sốt miễn dịch mẹ truyền cho lợn con bú sữa mẹ. Kháng thể trung hịa cĩ trong sữa đầu (1-3 ngày sau đẻ) cao gấp 4 trong huyết thanh mẹ (Clement & cs., 2016).
Nguồn: Clement & cs. (2016)
Hình 2.12. Kháng thể VNT trong huyết thanh, sữa đầu và sữa thường
Phản ứng huyết thanh học cĩ vai trị quan trọng trong cung cấp thơng tin cĩ giá trị để biết PEDV phơi nhiễm giai đoạn trước và tỉ lệ lưu hành nhiễm PEDV. Thêm vào đĩ phản ứng huyết thanh cho phép đánh giá các vắc xin hoặc các vắc xin chiến lược. Phản ứng miễn dịch giống như ELISAs và FIMA cũng cho phép đánh giá phản ứng miễn dịch đặc hiệu, phân loại các loại kháng thể PEDV (như
IgA, IgG) (Diel & cs., 2016).
So sánh phản ứng trung hịa và phản ứng ELISA, nhĩm tác giả (Paudel & cs., 2014a) khi so sánh giữa kháng thể trung hịa PEDV và kháng thể bằng
ELISA (kháng nguyên phủ đĩa là hạt virus hồn chỉnh) mức độ tương đồng 84,2% khi thực hiện 1024 mẫu huyết thanh thực địa. Tương quan giữa giá trị OD của ELISA và hiệu giá kháng thể trung hịa với giá trị R = 0,837. Tuy nhiên, nếu coi phản ứng trung hịa như chỉ tiêu vàng để đánh giá huyết thanh học khi hiệu giá kháng thể trung hịa ≤ 2 thì ELISA vẫn cĩ 34/ 270 mẫu dương tính giả. Nếu coi phản ứng trung hịa cĩ hiệu giá ≥4 là dương tính thì phản ứng ELISA âm tính
giả 21,6%. Trong nghiên cứu, tác giả đã dùng ELISA xác định kháng thể IgG,
tuy nhiên phản ứng trung hịa xác định được cả 2 IgM và IgG.
Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, phản ứng huyết thanh học là cơng cụ quan trọng để đánh giá phản ứng sinh miễn dịch của cơ thể khi tương tác PEDV. Sự phát triển đa dạng các phản ứng huyết thanh học ở mỗi phịng thí nghiệm khác nhau, ở mỗi bộ ELISA thương mại với các kháng nguyên gắn đĩa khác nhau, với mục đích phát hiện kháng thể globulin miễn dịch (IgA, IgG) khác nhau dẫn tới kết
quả đánh giá với độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Phản ứng trung hịa cĩ ưu thế, được xây dựng với các hĩa chất, sinh phẩm thơng dụng phịng thí nghiệm, nguồn virus phân lập thực địa, virus đại diện vùng - lãnh thổ, là yếu tố thiết thực trong
việc kiểm sốt tình trạng phơi nhiễm của đàn, đánh giá kháng thể bảo hộ và đánh
giá chất lượng của vắc xin đang lưu hành và vắc xin trong tương lai.
2.4.2. Phát hiện kháng thể bằng phản ứng ELISA
Cĩ 2 loại phản ứng ELISA được sử dụng xác định kháng thể kháng PEDV,
bao gồm ELISA gián tiếp (Hofmann & Wyler, 1990; Joseph & cs., 2015; Okda & cs., 2015) và ELISA cạnh tranh (Okda & cs., 2015). ELISA gián tiếp được
phát triển dựa trên kháng nguyên tồn phần của virus hoặc protein tái tổ hợp (protein S, N hoặc M). Protein N của PEDV là một nucleocapsid xoắn ốc với bộ
gen ARN, là vùng quyết định kháng nguyên quan trọng dùng nghiên cứu phát
triển kháng nguyên chẩn đốn bằng ELISA.
ELISA cạnh tranh hay ELISA blocking được phát triển dựa vào kháng thể PEDV đơn dịng hoặc đa dịng đặc hiệu gắn đĩa phản ứng. Ưu điểm của phản ứng ELISA blocking làm tăng độ nhạy khi so sánh ELISA gián tiếp, tuy nhiên phản ứng ELISA blocking phụ thuộc loại kháng thể blocking (Ana & cs., 1995).
Hiện nay, phản ứng ELISA gián tiếp (iELISA) và ELISA blocking (bELISA) dựa trên protein N cĩ giá trị dùng trong thí nghiệm và chẩn đốn lâm sàng với độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA gián tiếp là 97,9% và 97,6%, ELISA
blocking 98,2%và 98% (Okda & cs., 2015). Cả 2 phản ứng xác định được kháng
thể IgG đặc hiệu protein N sau khi lợn nhiễm PEDV 9-14 ngày. Kháng thể cao nhất sau 21 ngày nhiễm PEDV và duy trì 43 ngày sau khi nhiễm.
Phản ứng ELISA gián tiếp hiện nay được phát triển để đánh giá sự xuất hiện kháng thể IgG và IgA đặc hiệu trong dịch đường tiêu hĩa, đặc biệt kháng thể IgA đặc hiệu ở đường tiêu hĩa dường như tăng 100 ngày sau khi nhiễm PEDV. Kết quả này là thơng tin để kiểm sốt sự phơi nhiễm PEDV trong đàn.
Một đánh giá trước đây về phản ứng chéo, thí nghiệm được thực hiện bởi kháng thể đơn dịng dùng cho phản ứng bELISA với tất cả các dịng PEDV, các dịng đồng chủng và dịng dị chủng (CV777, PC177, S INDEL) thì đều cĩ hiệu giá kháng thể giống nhau. Nhưng khơng cĩ phản ứng chéo giữa kháng thể đơn dịng kháng protein S của PEDV và TGEV (dịng Miller và dịng Purdue) (Lin &
PHẦN 3. NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Virus PED phân lập thực địa tại miền Bắc Việt Nam, đã phân lập trên mẫu
bệnh phẩm từ năm 2016 đến năm 2018; - Vắc xin PEDV đại diện PEDV thuộc genogroup G1 lấy trong tháng 06
năm 2019 tại thị trường Việt Nam;
- Kháng thể trung hịa virus PED.
3.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
- Thời gian: Từ tháng 6/2019 đến tháng 6/2020;
- Địa điểm: Trung tâm kiểm nghiệm dược và sinh phẩm Cơng ty TNHH
Dược Hanvet-KCN Phố Nối A - Mỹ Hịa - Hưng Yên.
3.3. NGUYÊN LIỆU
3.3.1. Virus PED dùng trong nghiên cứu
- Virus PED phân lập thực địa dùng trong nghiên cứu là 4 mẫu PEDV phân lập từ bệnh phẩm của lợn con theo mẹ mắc tiêu chảy cấp, bệnh phẩm thu thập từ
năm 2016 đến năm 2018 tại miền Bắc Việt Nam, do phịng thí nghiệm Cơng ty
Hanvet cung cấp. Mỗi mẫu virus được chia nhỏ vào ống Eppendorf và bảo quản
ở -800C coi như là virus gốc cho việc nghiên cứu. Virus được giám định trong
nội dung nghiên cứu.
- Vắc xin PED nhược độc nhập khẩu, lấy mẫu trên thị trường tháng 6 năm 2019. Thơng tin ghi trên nhãn sản phẩm: vắc xin nhược độc đơng khơ sản xuất
tháng 01 năm 2019, hạn dùng tháng 06 năm 2021, bảo quản 4-80C. Dịng virus vắc xin được nhìn nhận ban đầu thuộc PEDV genogroup 1b, được giám định genogroup trong nội dung nghiên cứu.
3.3.2. Hĩa chất, sinh phẩm trong nghiên cứu
- Huyết thanh lợn, sữa đầu lợn nái (huyết thanh lợn nái, huyết thanh lợn con theo mẹ) thu mẫu ở trại âm tính và dương tính PEDV là nguồn mẫu so sánh kết quả giữa 2 phương pháp ELISA và phản ứng trung hịa mới xây dựng (trại dương
tính/âm tính được xác định bằng cách huyết thanh được làm ELISA, phân lợn
- Mẫu huyết thanh lợn tối miễn dịch kháng nguyên PEDV thực địa được tạo mẫu chuẩn dương phịng thí nghiệm gọi tắt mẫu chuẩn QC (+);
- Mẫu huyết thanh lợn khơng cĩ kháng thể kháng PEDV được xác định
bằng ELISA và phản ứng trung hịa, gọi tắt mẫu chuẩn QC (-); - Dịng tế bào Vero (ATCC - CCL-81);
- Mơi trường: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM- Gibco), huyết
thanh bào thai bị (FBS-Gibco); Tryptose Phosphate Broth (TBP-Merck); Yeast extract (YE-Merck); Trypsin 1: 250 (Gibco);
- Sinh phẩm, hĩa chất dùng nhuộm IPMA: anti- PEDV monoclonal antibody (Median Diagnostics Inc), HRP- conjugated goat anti- mouse IgG (US Biological); N, N-Dimethylformamide (Sigma); cơ chất 3-amino-9- ethylcarbazole (AEC- Sigma);
- PBS 1x, pH 7,2;
- Kít tách ARN (Patho Gene-spin DNA/RNA extraction kit, iNtRON 17154); - Bộ kít tổng hợp cDNA (MMLV reverse transcriptase, Promega, M1705), kít PCR (GoTaq G2 Hot Start Master, Promega, M7423); các bộ mồi đặc hiệu
giám định genogroup PEDV, phát hiện TGEV, Rotavirus được lấy theo nghiên
cứu trước đây (Song & cs., 2006; Zhao & cs., 2014);
- Nghiên cứu dùng đối chứng dương ARN- PEDV dùng trong phản ứng
RT- PCR: vắc xin PEDV nhược độc cơng ty Deasung Hàn Quốc;
- Vắc xin kép chứa TGEV và Rotavirus ProSystem 2143 (Intervet) làm đối
chứng dương ARN TGEV và Rotavirus;
- Thang ADN chuẩn:100 bp (hãng Cleverscientific), đối chứng dương
chuẩn của Rotavirus và TGEV (vắc xin Prosysterm, Merck Animal Health). - Bộ ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể PEDV (Swinecheck PED
indirect- TRM-558, Biovet);
- Bộ phản ứng ELISA (được thiết lập theo tiêu chuẩn cơ sở) phát hiện
kháng thể kháng protein S của PEDV.
3.3.3. Vật tư và thiết bị
- Các loại chai T-flask, đĩa nuơi cấy tế bào 96 giếng (Corning cung cấp); - Các loại Pippete, các loại đầu cơn (Ependorf cung cấp);
- Tủ nuơi ấm 5% CO2 ;
- Máy PCR (Proflex PCR- Applied Biosysterms); - Bộ điện di và đọc kết quả PCR.
Hình 3.1. Hĩa chất, sinh phẩm nghiên cứu
Hình 3.2. Thiết bị và phịng thí nghiệm đạt chuẩn GLP3.4. NỘI DUNG 3.4. NỘI DUNG
3.4.1. Lựa chọn chủng PEDV dùngtrong nghiên cứu
- Xác định đặc tính sinh học và hiệu giá virus;
- Giám định tính thuần khiết của chủng PEDV; - Xác định độc lực của chủng PEDV thực địa.
3.4.2. Kết quả thiết lập phản ứng trung hịa
- Kết quả tối ưu mơi trường dùng trong phản ứng trung hịa;
3.4.3. Xác định giá trị sử dụng phản ứng trung hịa
- Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu trên nền mẫu thực địa
- Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC
- Phản ứng trung hịa xác định kháng thể ở huyết thanh và sữa đầu