Kỹ thuật di truyền

Kỹ thuật di truyền bắt đầu như một khoa học từ 7/1972 khi nhóm nghiên cứu của Paul Berg (Viện hàn lâm khoa học quốc gia Mỹ) hoàn thành việc chế tạo bộ gen lai giữa virus SV40 của khỉ với phage lambda. Lần đầu tiên kết nối hai virus khác nhau hoàn toàn về mặt di truyền thành một chỉnh thể và được nhân lên dưới dạng plasmid trong tế bào vi khuẩn. Phân tử DNA lai chứa các thông tin di truyền của virus SV40, thông tin điều khiển quá trình tự sao của DNA phage lambda cũng như toàn bộ chức năng của operon galactosidase của vi khuẩn E. coli. Ban đầu khái niệm kỹ thuật di truyền chỉ các kỹ thuật tái tổ hợp DNA nhưng

dần dần nội dung của thuật ngữ này mở rộng tới các kỹ thuật liên quan như PCR với các biến tướng PCR, kỹ thuật lai phân tử (Northern hybridization, Southern hybridization, microarray,...

Nguyên tắc chung của công nghệ DNA tái tổ hợp gồm một số bước. Trước hết DNA genome mục tiêu và DNA chuyển tải (vector) được tinh chế và cắt thành đoạn nhờ một loại enzyme hạn chế. Trong nhiều trường hợp (đặc biệt đối với sinh vật bậc cao) DNA genome mục tiêu được thay thế bằng DNA tương bù (cDNA) của RNA thông tin thành thục. DNA này được tổng hợp từ khuôn RNA thông tin nhờ sự xúc tác của enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA-polymerase). DNA vector có thể là của một plasmid hoặc phage (nếu vật mang, dòng hóa gen là vi khuẩn), plasmid Ti của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens (nếu vật mang dòng hóa gen là tế bào thực vật), là virus (retrovirus hoặc adenovirus không gây bệnh, nếu vật mang dòng hóa gen mục tiêu trong tế bào động vật). Bước thứ hai là chuyển vận DNA tái tổ hợp vào cơ thể vật mang, dòng hóa và bước tiếp sau đó là sau đó nuôi cấy vật mang, sản xuất (chiết xuất và tinh chế) sản phẩm mục tiêu.

Nhờ được cắt cùng một loại enzyme hạn chế (thường là enzyme đầu dính) các đoạn DNA mục tiêu và các DNA vector (chỉ cắt tại một điểm của mạch vòng xoắn kép) có thể ngẫu nhiên hình thành mối liên kết hyđrô tương bù ở các đầu dính, rồi được enzyme ligase hàn gắn các đầu khấc. Kết quả là trong hỗn hợp hình thành thể tái tổ hợp vector với một hoặc một số mảnh DNA của genome mục tiêu (bên cạnh các sản phẩm không mong muốn như vector tự khép vòng, các vector tự tái tổ hợp với nhau và các mảnh DNA không tái tổ hợp hoặc tự tái tổ hợp). Tất cả các sản phẩm trong hỗn hợp đều được trộn với các vật mang tạo dòng, sau đó các vật mang được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có chứa yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh đối với vi khuẩn, hóa chất gây chết đối với tế bào động vật và thực vật). Trong điều kiện đó, chỉ các tế bào vật mang mang vector sống sót. Hơn nữa, do plasmid bị enzyme hạn chế cắt tháo vòng tại một vị trí xác định trong một gen điều khiển một thuộc tính nhận biết khác, những plasmid đã tái tổ hợp mất khả năng tạo tính trạng đó ở vật mang (chẳng hạn, mất khả năng tổng hợp beta-galactosidase), nên chỉ những vật mang sống sót và không biểu hiện tính trạng đó được chọn nuôi cấy tạo dòng. Bước tiếp theo là chọn những dòng biểu hiện tính trạng của gen mục tiêu hoặc những dòng mang gen mục tiêu (nhờ lai phân tử: các phương pháp thử nghiệm miễn dịch như ELISA, Western blot analysis hoặc với các dò DNA hoặc RNA - Southern blot analysis, Northern blot analysis), hoặc PCR. Nuôi cấy tạo dòng những cá thể vật

mang thỏa mãn các bước thử nghiệm trên giúp tạo ra dòng thuần các sinh vật mang có thể sản xuất các sản phẩm mục tiêu.

Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đã đạt được những bước tiến vượt bậc. Nhiều sản phẩm có ích đã được sản xuất từ các sinh vật tái tổ hợp hay sinh vật biến đổi gen (genetically modified organisms - GMO) như giống ngũ cốc, đậu tương, hạt có dầu, bông,... mang gen chống sâu bệnh hoặc kháng thuốc chống cỏ dại hoặc có chất lượng sản phẩm nâng cao như khoai tây chứa nhiều protein, lúa giàu vitamin A và sắt,... tạo ra được những vaccine tái tổ hợp có thể dễ sản xuất (dễ nuôi cấy trên lứa cấy tế bào hay phôi gà) và dễ sử dụng (cho ăn, cho uống), hoặc các động vật tái tổ hợp sản sinh những sản phẩm hữu ích như thuốc chữa bệnh, thậm chí tạo ra những đàn lợn mang kháng nguyên người hy vọng có thể là vật cho tim hoặc nội quan khác đểđiều trị những trường hợp người bệnh cần phải thay thế nội quan,... Tuy nhiên, kỹ thuật di truyền cũng đặt loài người vào tình trạng có thể phải đương đầu với những đe dọa mới liên quan đến sức khỏe của người và sinh thái - môi trường. Chưa thể chứng minh được tính vô hại của GMO thực phẩm đối với con người, cũng như chưa thể phủ nhận khả năng lan truyền gen kháng thuốc (của plasmid vector) trong tập đoàn các vi khuẩn tự nhiên của cơ thể (ví dụ, trong đường ruột) người và động vật. Chăm sóc những loại cây trồng đề kháng thuốc diệt cỏ và thuốc diệt sâu bệnh có thể dẫn đến lạm dụng nông dược và nếu thoái hóa trở thành cỏ dại thì thực vật kháng thuốc và kháng sâu bệnh sẽ là một nguy cơ mới đối với nông nghiệp. Tương tự, nguy cơ những sinh vật GMO lấn át sinh vật tự nhiên là rất cao và có thể dẫn đến sự tuyệt diệt của nhiều loài sinh vật hiện có, ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái,...

PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp: polymerase chain reaction) là một kỹ thuật riêng biệt được sáng tạo để khuyếch đại DNA in vitro dựa trên cơ sở phản ứng tự sao của DNA nhờ DNA-polymerase từ các deoxyribonucleoside triphosphate luôn cần mồi (primer) là đoạn oligonucleotide (trong tế bào là đoạn RNA do primase xúc tác tổng hợp) gắn kết sẵn một cách tương bù trên khuôn sợi đơn của phân tử DNA. Hiện thực hóa nguyên lý trên để áp dụng trong ống nghiệm được xúc tiến nhờ những tiến bộ trong kỹ thuật như: tổng hợp được các mạch oligonucleotide có trình tựđặc hiệu biết trước từ các deoxyribonucleoside triphosphate, thành công trong việc chế tạo máy chu kỳ nhiệt hay máy luân nhiệt (thermocycler) và tinh chếđược enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt (từ vi khuẩn ưu nóng Thermus aquaticus - Taq polymerase, sau đó từ E. coli tái tổ hợp gen này của Thermus aquaticus - rTaq polymerase). Trong máy luân nhiệt, hỗn hợp gồm DNA, dNTP, DNA-polymerase, cặp oligonucleotide mồi và dung dịch đệm được gia nhiệt (94 - 96 °C), khi đó các DNA mạch đôi biến tính thành chuỗi đơn, sau đó khi máy hạ nhiệt

xuống khoảng 40 - 60 °C thì các oligonucleotide mồi sẽ gắn vào các vị trí đặc hiệu (có trình tự nucleotide tương bù) và cung cấp đầu 3'-OH cho DNA polimerase gắn vào, khi gia nhiệt lên khoảng 60 - 75 °C polymerase hoạt động gắn kết các dNTP tương bù kéo dài sợi mới theo hướng 5'→3' làm cho sợi đơn trở thành sợi đôi bắt đầu từđiểm gắn mồi. Tiếp tục các chu kỳ gia nhiệt gây biến tính (denaturation), hạ nhiệt gây gắn mồi (annealling) rồi nâng nhiệt gây kéo dài (elongation) ta có thể tổng hợp được lượng lớn sợi đơn mới. Do hai mồi trong hỗn hợp được thiết kế có thể gắn đặc hiệu với hai sợi đơn khác nhau sao cho mạch mới tổng hợp của mồi này cung cấp chỗ gắn cho mồi kia nên sau một số khá lớn (25 - 40) chu kỳ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp với số lượng lớn áp đảo. Nếu cho sản phẩm phản ứng di động trong gel nhờ dòng điện một chiều bên cạnh các đoạn DNA có phân tử lượng (DNA molecular weight marker) biết trước và nhuộm ethidium bromide rồi soi dưới tia tử ngoại, ta có thể nhận ra các băng DNA và xác định được phân tử lượng của sản phẩm (cũng như sự thuần khiết của sản phẩm). Do hai mồi được thiết kế một cách đặc hiệu với trình tự DNA biết trước hay do mỗi sinh vật có trình tự DNA đặc hiệu nên sản phẩm được PCR tổng hợp có phân tử lượng đặc hiệu (do tính đặc hiệu của trình tự nucleotide). Nhờ đó có thể dùng phản ứng này để nhận biết sự hiện diện của một đoạn gen cho trước hoặc để chẩn đoán bệnh (đồng định: nhận biết sự hiện diện của mầm bệnh) hoặc nhận diện (đồng định) cá thể. Để tăng hiệu quả của PCR, mở rộng phạm vi sử dụng của nó hoặc áp dụng để nhân DNA từ khuôn RNA, hàng loạt biến tướng của kỹ thuật này được thiết lập (nested PCR, LA PCR, hot start PCR, RAGE, panhandle PCR, inverse PCR,...).

Ngoài kỹ thuật PCR thông thường (conventional PCR) nêu trên còn có PCR thực thời (real-time PCR) được phát triển trên cơ sở phản ứng PCR thông thường với cặp mồi đặc hiệu và một dò chỉ hấp thụ và phát xạ (bức xạ bước sóng đặc hiệu) khi gắn với DNA đoạn giữa hai mồi tổ hợp với thiết bịđặc biệt trắc định cường độ phát xạ của dò ngay trong quá trình phản ứng.

PCR còn được sử dụng trong việc xác định trình tự nucleotide

(sequencing) của DNA. Khi đó, có thể sử dụng trực tiếp sản phẩm khuếch đại nhờ PCR hoặc các đoạn DNA đã được dòng hóa. Nguyên tắc chung là khuyếch đại một đoạn DNA nhờ một mồi với hỗn hợp gồm DNA khuôn, một mồi duy nhất bắt cặp với đầu 5' của đoạn DNA cần đọc trình tự, Taq DNA-polymerase, các dNTP cùng với một trong bốn loại ddNTP (dideoxyribonucleotide) đã được đánh dấu huỳnh quang (hoặc phóng xạ,...) trong mỗi lọ trong bốn lọ phản ứng (hoặc bốn loại đánh dấu khác nhau trong một lọ phản ứng chung). Phản ứng xảy nối dài bắt đầu từ mồi và kết thúc khi gắn kết với một ddNTP đánh dấu (do ddNTP thiếu gốc 3'-

OH cần thiết cho phản ứng tiếp tục). Do việc gắn kết với các phân tử ddNTP là tương bù đặc hiệu và ngẫu nhiên giữa một ddNTP với dNTP cùng loại nên sau khi biến tính kết quả phản ứng (bằng nhiệt, có thêm formamide) ta có hỗn hợp chứa các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau. Khi điện di (trong polyacrylamide gel bão hòa urea) trong bốn làn (lane) cạnh nhau (với trường hợp đánh dấu cùng loại) hoặc trong một làn (với trường hợp đánh dấu khác loại) các đoạn dài ngắn khác nhau sẽ di động với tốc độ khác nhau. Kết quả là ta có các băng (band) phân bố liên tiếp (lần lượt, đọc từ băng di động nhanh nhất) phụ thuộc vào độ dài của mạch đơn nucleotide tức phụ thuộc vào vị trí gắn kết của một loại ddNTP. Trình tựđọc được chính là trình tự nucleotide của đoạn DNA bắt đầu từ mồi.

Lai phân tử (hybridization) có thể giúp nhận biết sự hiện diện của một phân tử đặc hiệu nào đó, gồm lai Southern (phân tích DNA) hoặc Northern (phân tích RNA) và các kỹ thuật miễn dịch học như Western blot analysis và ELISA. Một trình tự mạch đơn (DNA hoặc RNA) biết trước gọi là dò (probe) được đánh dấu (bằng chất phóng xạ) được chuẩn bị sẵn và cho tiếp xúc với sản phẩm RNA hoặc DNA sợi đơn đã cố định trên giá thể (màng nylon hoặc màng nitrocellulose), nếu có trình tự tương bù dò sẽ gắn kết một cách đặc hiệu. Sau khi rửa kỹ màng giá thể, nếu phát hiện được dò (nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ký) trên màng chứng tỏ trong sản phẩm có chứa trình tự nucleotide tương bù. Western blot analysis là phương pháp lai kháng thể gắn kết với một enzyme có khả năng chuyển màu cơ chất thích hợp (đánh dấu bằng peroxidase hoặc phosphotase kiềm) với sản phẩm đã cố định trên màng, trong khi ELISA là phương pháp lai kháng thểđánh dấu với sản phẩm đã cốđịnh trên bề mặt lỗ khay. Nếu trong sản phẩm có kháng nguyên đặc hiệu thì kháng thểđánh dấu sẽ kết hợp đặc hiệu và không bị rửa trôi. Kết quả là nếu phát hiện được yếu tốđánh dấu (nhờ kỹ thuật chuyển màu cơ chất enzyme) thì chứng tỏ trong sản phẩm có kháng nguyên hay protein đặc hiệu.

Câu hỏi ôn tập chương 10

1. Vật chất di truyền ở sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus? 2. Sự tự sao DNA? 2. Sự tự sao DNA? 3. Quá trình phiên mã? 4. Quá trình dịch mã? 5. Sựđiều tiết phiên mã và điều tiết dịch mã? 6. Cải biến và hạn chế? 7. Biến dị kiểu hình? 8. Đột biến? 9. Biến nạp (chuyển thể) ở vi khuẩn?

10. Tải nạp ở vi khuẩn? 11. Tiếp hợp ở vi khuẩn? 11. Tiếp hợp ở vi khuẩn? 12. Tương tác di truyền ở virus"

13. Kỹ thuật di truyền và công nghệ DNA tái tổ hợp?

14. PCR cần những yếu tố hóa học gì, những điều kiện phản ứng như thếnào? nào?

15. Các kỹ thuật lai phân tử dựa trên tính chất cơ bản gì của các yếu tố tham gia phản ứng? gia phản ứng?