Sau khi khoan lấy lõi xương sụn, lớp sụn khớp bề mặt sẽ được loại bỏ và vùng xương dưới sụn được đặt trở lại vị trí cũ Mơ hình tạo tổn thương của nhĩm nghiên cứu đã loại bỏ hồn tồn lớp sụn khớp bề mặt, tuy nhiên cách tạo tổn thương này cũng sẽ gây kích thích TBGTM từ tủy xương xâm nhập vùng tổn thương qua vị trí khoan Tuy vậy, khi quan sát quá trình lành thương nhận thấy ở nhĩm chứng (nhĩm khơng ghép) hồn tồn khơng cĩ sự tái tạo phục hồi của lớp mơ sụn nội tại Do đĩ cĩ thể kết luận yếu tố TBGTM từ tủy xương khơng ảnh hưởng đến kết quả đánh giá sự tái tạo mơ sụn của mảnh ghép
Với kết quả 3 trường hợp ghép thất bại mà nhĩm nghiên cứu ghi nhận, đây là 3 trường hợp ghép đầu tiên khi tiến hành nghiên cứu Nguyên nhân thất bại được xác định là do thời gian phẫu thuật kéo dài do kỹ thuật chưa hồn thiện, đồng thời việc chăm sĩc hậu phẫu ngắn (ban đầu chỉ chăm sĩc hậu phẫu 3 ngày, sử dụng kháng sinh sau mổ 5 ngày) Sau đĩ nhĩm nghiên cứu tăng thời gian chăm sĩc hậu phẫu và sử dụng kháng sinh sau mổ lên 7 ngày thì khơng ghi nhận tình trạng nhiễm trùng xảy ra Nhĩm nghiên cứu cũng loại trừ nguyên nhân phản ứng miễn dịch do ghép bởi vì giá thể màng chân bì sau thu nhận qua các bước xử lý và chiếu tia gamma đã loại bỏ hồn tồn tế bào và các yếu tố miễn dịch, khi sử dụng để nuơi cấy tế bào cũng cho thấy giá thể màng chân bì hồn tồn tương thích sinh học với tế bào của thỏ Đối với việc cĩ phản ứng miễn dịch do ghép đồng loại, nhĩm nghiên cứu nhận thấy trong nhĩm ghép tấm tế bào sụn chỉ cĩ 1 trường hợp phải hủy ghép trong tổng số 9 trường hợp ghi nhận ghép thành cơng nên khả năng bị phản ứng miễn dịch khơng nghĩ tới Ngồi ra,
TBGTM cũng đã được chứng minh cho thấy khả năng tiết ra các yếu tố điều hịa miễn dịch và kháng viêm [47], [100] Điều này củng cố cho giả thiết trường hợp ghép tấm tế bào sụn thất bại là do bị nhiễm trùng sau mổ chứ khơng phải do phản ứng miễn dịch của ghép đồng loại
Từ kết quả đánh giá mơ học thu nhận được ở 3 mốc thời gian 1, 2 và 3 tháng cho thấy ở giai đoạn sớm là quá trình viêm diễn ra với hoạt động mạnh của đại thực bào và
bạch cầu giúp tiêu hủy các tế bào và mơ hoại tử hình thành trong quá trình phẫu thuật, ở nhĩm ghép mảnh sụn cơng nghệ mơ thấy hoạt động viêm chấm dứt sớm hơn và các tế bào sụn trên mảnh ghép vẫn tồn tại và hiện diện trong suốt quá trình viêm chứ khơng bị tiêu hủy
Sau khi kết thúc quá trình viêm thì giai đoạn tái tạo mơ được tiến hành với sự gia tăng hoạt động của nguyên bào sợi, tạo mơ sợi che phủ vùng ghép Tại giai đoạn này thì khơng thấy sự hiện diện của mơ sụn hay tế bào sụn tân sinh ở nhĩm đối chứng Ở nhĩm 1 thỏ được ghép màng chân bì khơng tế bào vào mốc 2 tháng quan sát thấy khơng cịn sự hiện diện của mảnh ghép màng chân bì mà được mơ sợi thay thế hồn tồn, tuy nhiên ở vùng sụn chủ xung quanh cĩ hiện tượng tân sinh mơ sụn mới và lớp mơ tân sinh này chỉ phát triển như một lớp màng trung mơ bám sát vùng xương dưới sụn Nhĩm thỏ ghép tấm tế bào sụn lúc 2 tháng đã hình thành một lớp mơ giống với mơ sụn chủ và kết dính với rìa vùng ghép, che phủ vùng ghép hồn tồn và giai đoạn tân sinh mơ sụn tiếp tục phát triển đến 3 tháng tạo ra một lớp mơ sụn dày và chắc
Ở kết quả ghép của nghiên cứu chúng tơi ghi nhận sau ghép 3 tháng khơng cĩ sự cải thiện đáng kể nào liên quan đến khả năng tái sinh nội tại ở nhĩm đối chứng (cả trên hình ảnh quan sát đại thể và nhuộm mơ học) Khi so sánh kết quả ghép, nhận thấy kết quả ghép trên các thỏ cĩ mang tấm tế bào sụn thì thời gian lành thương và chất lượng mơ sụn tái tạo là tốt hơn và nhanh hơn so với nhĩm chứng và nhĩm thỏ chỉ ghép màng chân bì khơng cĩ tế bào trong khoảng thời gian từ 1 - 3 tháng Từ kết quả đánh giá mơ học nhuộm H&E, trichrome và Safranin O cĩ thể xác định chính xác tấm tế bào sụn cho kết quả tái tạo mơ sụn bị tổn thương phục hồi tốt hơn, mơ sụn tân sinh dính vào mơ sụn chủ và cĩ đặc tính tương đồng với mơ sụn chủ
Mơ hình động vật thỏ được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu về đánh giá hiệu quả của giá thể (cĩ hoặc khơng cĩ tế bào) trong việc phục hồi và tái tạo mơ sụn, là cơ sở để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trên mơ hình động vật lớn phù hợp về mặt lâm sàng như cừu, dê, ngựa và sau đĩ là thực nghiệm trên người [58], [132] Về hiệu quả của giá thể collagen thu nhận từ màng chân bì trong việc phục hồi, tái tạo mơ sụn của nghiên cứu chúng tơi ghi nhận cĩ sự tương đồng với nghiên cứu của tác giả Ken Ye và cộng sự [174] cho thấy kết quả sau ghép 3 tháng ghi nhận mơ sụn phục hồi
tốt so với nhĩm khơng điều trị, giá thể màng chân bì giúp tái tạo mơ sụn trong Màng chân bì da là một giá thể sinh học phù hợp cho việc nuơi cấy tế bào, đặc biệt là trong lĩnh vực tái tạo mơ sụn bởi vì cấu tạo mạng lưới collagen loại II tương đồng với mơ sụn tự nhiên [165], [173] Do đĩ việc sử dụng giá thể màng chân bì như là một sự bổ sung chất nền tương tự như chất nền đặc trưng của sụn bị thiếu hụt, đồng thời việc cấy ghép TBGTM sẽ hiệu quả hơn và thời gian lành thương nhanh hơn Hơn nữa, chiến lược này cĩ thể cho phép chúng ta tránh được những bất lợi hiện tại của phương pháp phẫu thuật tái tạo sụn hai bước hiện tại bao gồm việc lựa chọn vật liệu sinh học tương thích, tạo ra các tế bào sụn trong ống nghiệm từ TBGTM và việc ghép chúng vào khớp bị tổn thương Các tế bào sụn được biệt hĩa từ TBGTM in vitro nằm trong mơ bị tổn thương dạng sợi chủ yếu là các tế bào giống như nguyên bào sợi hình thoi, cĩ khả năng tổng hợp collagen loại I khơng hồn tồn tương thích với cấu trúc mơ sụn và tế bào sụn khớp bình thường in vivo Kết quả của kỹ thuật này cho thấy sự hình thành các mơ sụn xơ hoặc mơ xương, cả hình thái mơ học và cơ học đều khác với mơ sụn nội sinh xung quanh [17], [149] Điều này cũng thường xảy ra ngay cả khi sử dụng thế hệ mới nhất của các vật liệu sinh học như keo fibrin, chất nền tế bào, gel collagen và alginate cho đến oligostilbenoid cĩ nguồn gốc từ axit hyaluronic, axit polylactic và axit polyglycolic [45], [104], [131]
Về mặt kỹ thuật, việc sử dụng các tế bào sụn tự thân khơng phải lúc nào cũng thuận lợi và khơng xảy ra sự cố Chúng phải được nuơi cấy và nhân khối trong ống nghiệm trước khi được cấy vào trong lần phẫu thuật thứ hai mà khơng phải lúc nào cũng dễ dàng thực hiện được, ngồi ra việc sử dụng tế bào sụn tự thân phải kỹ càng do lượng mơ sụn tự thân rất hạn chế Keo fibrin được sử dụng như một vật liệu để lắp kín tổn thương cĩ thể được thay thế dần bởi mơ sợi trong khoảng thời gian dưới 21 ngày và nĩ cĩ thể là một rào cản chống lại sự di chuyển của tế bào sụn, hạn chế quá trình chữa lành chính xác [44], đồng thời tế bào được ghép khi đĩ lại tạo ra collagen tuýp 1 và sau 2 tuần đánh giá cĩ độ nhạy với DNA của tế bào sụn tự nhiên và chất nền proteoglycan khi so với TBGTM được cấy trên giá thể collagen loại II [40] Các hợp chất acid hyaluronic tuy là một sự hỗ trợ phù hợp trong liệu pháp tái tạo sụn, các sản phẩm này ở dạng quá lỏng để được sử dụng làm giá thể chức năng phù hợp để chứa
các tế bào Ngồi ra, quy trình này vẫn khơng giải quyết được vấn đề của chất nền collagen loại II, rất cần thiết cho sự phục hồi hồn tồn của các mơ sụn chức năng
Trong nghiên cứu của tác giả Manuel Mata và cộng sự [109] đánh giá sự phục hồi mơ sụn của mảnh ghép từ sự kết hợp của tế bào gốc tủy răng và giá thể alginate cho thấy kết quả tái tạo mơ sụn của nhĩm thỏ được ghép giá thể cĩ tế bào gốc vượt trội hơn so với nhĩm chứng chỉ ghép giá thể khơng cĩ tế bào, và thậm chí mảnh ghép cĩ tế bào gốc cho kết quả phục hồi mơ sụn tốt hơn cả mảnh ghép mang tế bào sụn cĩ thể là do tác dụng chống viêm của tế bào gốc Tác giả chứng minh nguồn tế bào trung mơ từ tủy răng cĩ thể được sử dụng thay cho tế bào sụn vì khả năng tăng sinh và tái tạo sụn tốt hơn Kết quả này tương đồng với ghi nhận khi quan sát hình ảnh đại thể và trên mơ học trong giai đoạn sau ghép 1 tháng của chúng tơi, tại nhĩm chứng và nhĩm chỉ ghép màng chân bì thấy rõ sự hiện diện của tế bào viêm xâm nhập vào vùng ghép cùng với việc tăng sinh mơ sợi, nhưng bên nhĩm thỏ được ghép tấm tế bào sụn thì giai đoạn này thấy ít tế bào viêm hoặc gần như khơng thấy hiện diện tế bào viêm xâm nhập vào vùng ghép Điều này chứng tỏ là tấm tế bào sụn cĩ tác dụng chống viêm của TBGTM, giúp cho quá trình viêm kết thúc sớm hơn so với nhĩm chứng và nhĩm chỉ ghép màng chân bì khơng được bổ sung TBGTM Nghiên cứu của chúng tơi tuy khơng so sánh hiệu quả tái tạo mơ sụn giữa TBGTM và tế bào sụn nhưng kết quả so sánh với nhĩm thỏ chỉ ghép giá thể màng chân bì khơng cĩ tế bào và nhĩm chứng cũng chỉ rõ hiệu quả nổi trội của mảnh ghép mang TBGTM trong việc phục hồi mơ sụn nhanh hơn và hiệu quả hơn
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tơi đạt được các kết luận sau:
1 Đã thiết lập được quy trình phân lập, nuơi cấy và định danh TBGTM từ mơ mỡ thỏ một cách hiệu quả
Tế bào thu được trên 1 gam mơ mỡ lấy trung bình từ 6 mẫu mơ đã thu nhận là vào khoảng 4,6 x 105 tế bào
Quần thể tế bào thu nhận được cĩ đường cong tăng trưởng đạt đỉnh vào ngày thứ 6 sau nuơi cấy, sau đĩ giảm dần đến ngày thứ 14
Nguồn tế bào thu nhận được thỏa các tiêu chí về TBGTM của ISCT: hình thái giống nguyên bào sợi, khả năng bám dính trên bề mặt chai nuơi và cĩ tiềm năng biệt hĩa thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ
Đánh giá biểu hiện các dấu ấn bề mặt TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ ghi nhận dương tính với CD14, CD73, CD105, CD106, CD44 và âm tính với CD34, CD45, CD90 ở thế hệ thứ 3
2 Đã thiết lập được quy trình tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM mơ mỡ thỏ và màng chân bì da người
Thu nhận thành cơng giá thể màng chân bì da người, thỏa các điều kiện của 1 giá thể đáp ứng các tiêu chí sinh học về độ vơ khuẩn và khơng gây độc cho tế bào, phù hợp cho tế bào bám dính và tăng sinh
Quần thể TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ sau khi cảm ứng biệt hĩa tạo sụn với các mốc thời gian 7, 14 và 21 ngày cĩ sự biểu hiện rõ ràng với các gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2
Đã thiết lập được quy trình tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM từ mơ mỡ thỏ và màng chân bì Lớp TBGTM được cảm ứng tạo sụn bám dính và phát triển trên giá thể màng chân bì Đánh giá một số đặc điểm của tấm tế bào sụn được tạo ra bằng mơ học (nhuộm H&E và Safranin O) và SEM cho thấy tấm tế bào sụn cĩ các đặc tính và mang tế bào tương đồng với
mơ sụn, TBGTM tăng trưởng trên cấu trúc màng chân bì và biệt hĩa tiết ra chất nền sụn đặc trưng
3 Đã xây dựng thành cơng mơ hình đánh giá hiệu quả của tấm tế bào sụn phục hồi tổn thương bề mặt sụn khớp trên mơ hình thỏ và đánh giá được kết quả mảnh ghép với các mốc theo dõi là 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng
Thực hiện ghép thành cơng 18 con thỏ, trong đĩ cĩ 9 con thỏ mang mảnh ghép tấm tế bào sụn và 9 con thỏ mang mảnh ghép màng chân bì khơng cĩ tế bào với thời gian theo dõi 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng
Kết quả đánh giá dựa vào hình ảnh mơ học (Nhuộm H&E, Trichrome và Safranin O) cho thấy tấm tế bào sụn được tạo từ TBGTM từ mơ mỡ thỏ và màng chân bì da người cĩ hiệu quả tái tạo mơ sụn tốt hơn so với nhĩm chứng khơng ghép và nhĩm chỉ ghép màng chân bì khơng mang tế bào Nhĩm ghép tấm tế bào sụn quan sát thấy sự phục hồi của lớp mơ sụn bị tổn thương tốt hơn và mảnh ghép gắn kết chặt chẽ và cĩ đặc tính mơ học tương đồng với vùng mơ sụn chủ
KIẾN NGHỊ
Từ kết quả thu được qua nghiên cứu, nhằm tăng tính chính xác chúng tơi cĩ một số đề nghị sau:
- Thực hiện thêm các đánh giá về sự biệt hĩa in vivo của tấm tế bào sụn như nhuộm hĩa mơ miễn dịch với các protein chất nền đặc trưng cho mơ sụn - Khảo sát sự biểu hiện gien tạo sụn của tấm tế bào sụn in vitro và in vivo
- Tiến hành ghép thực nghiệm trên mơ hình động vật lớn cĩ cấu trúc khớp tương đồng với người hơn
Dang, Q T , et al , Human Chondrocytes from Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Seeded on a Dermal-Derived Collagen Matrix Sheet: Our Preliminary Results for a Ready to Go Biotechnological Cartilage Graft in Clinical Practice Stem Cells International, 2021
+ Tạp chí trong nước:
và cộng sự, Thiết lập quy trình thu nhận tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ thỏ Y Học TP Hồ Chí Minh, 2021 25(1)
và cộng sự, Điều trị tổn thương sụn khớp bằng mảnh ghép tế bào gốc trên mơ hình động vật Y Học TP Hồ Chí Minh, 2021 25(4)
1 Tăng Hà Nam Anh, Lương Đình Lâm, (2007), "Nhân các trường hợp ghép xương sụn tự thân trong hư hỏng nặng sụn khớp gối", Y Học TP Hồ Chí Minh, 11 (1), trang 460-464
2 Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Quốc Bình, (2015), "Nuơi cấy tế bào gốc trung mơ biệt hĩa sụn trên giá thể ba chiều", Đề tài nghiên cứu khoa học Sở Khoa học - Cơng nghệ TPHCM
3 Trần Lê Bảo Hà, Tơ Minh Quân, Đồn Nguyên Vũ, (2012), Cơng nghệ vật liệu sinh học, NXB Giáo dục Việt Nam
4 Hồng Kc Hương, Huỳnh Duy Thảo, Võ Quốc Vũ, et al, (2014), "Nghiên cứu quy trình thu nhận màng trung bì từ da người", Y học Việt Nam, 424, trang 177 5 Bùi Hồng Thiên Khanh, Đỗ Phước Hùng, Lê Văn Tuấn, (2016), Nghiên cứu ứng
dụng ghép sụn xương tự thân điều trị tổn thương sụn khớp gối, Sở Khoa học - Cơng nghệ TP HCM
6 Hồ Phạm Thục Lan, Nguyễn Văn Tuấn, (2017), Thối hĩa khớp yếu tố nguy cơ và di truyền, Sở Khoa học - Cơng nghệ TP HCM
7 Dương Đình Tồn, Đào Xuân Tích, Nguyễn Thị Thu Hà, (2015), Nghiên cứu ứng dụng phẫu thuật nội soi tạo tổn thương dưới sụn và ghép khối tế bào gốc tủy xương tự thân trong điều trị thối hĩa khớp gối, Đại học Y Hà Nội
8 Đặng Thị Hà Thanh, Huỳnh Duy Thảo, Lê Thanh Hùng, et al, (2017), "Tạo mảnh ghép sụn từ tế bào gốc trung mơ và giá thể collagen hướng đến tái tạo tổn thương bề mặt sụn khớp", Y học thành phố Hồ Chí Minh, 21
9 Huỳnh Duy Thảo, Trần Lê Bảo Hà, (2013), "Nghiên cứu quy trình thu nhận tế bào