Trong l nh vực kiểm soát môi trƣờng và an toàn thực phẩm, cảm biến sinh học đƣợc nghiên cứu phát triển thành các kit thử nhanh chỉ thị màu để xác định các sản phẩm biến đổi gen, các chất hữu cơ độc hại và khó phân hủy, dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong nƣớc, đất, thực phẩm, … Một số các hợp chất khi tham gia phản ứng sinh học sẽ cho sản phẩm có màu thay đổi tùy thuộc vào nồng độ của chất đó. Màu sắc của cảm biến đƣợc ghi nhận nhờ các camera có trên điện thoại di động và phân tích các kết quả thu đƣợc bằng các ứng dụng cài đặt trong máy.
1.5 Tổng quan các phƣơng pháp xác định phenol
Có nhiều phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại đang đƣợc sử dụng để định lƣợng phenol và các dẫn xuất nhƣ phƣơng pháp sắc ký, cực phổ, quang phổ.
1.5.1 Phương pháp sắc kí
Dẫn xuất t–Butyldimethylsilyl giữa các chất họ phenol với N–(t– butyldimethylsilyl)–N–methyl–trifuoroacctamid đƣợc xác định ằng phƣơng pháp sắc ký khí với đầu dò khối phổ ẫy ion (IT – MS). Ở chế độ tiêm không chia dòng, 2L mẫu xác định đƣợc cho vào cột DB–5 MS 30m 25m cùng với chƣơng trình nhiệt thích hợp cho phép xác định 2,4–dinitrophenol và hợp chất methyl phenol ở hàm lƣợng vết.
Ngoài ra, có 15 hợp chất phenol đã đƣợc xác định ằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu n ng cao theo cơ chế sắc ký khí phân ố pha đảo. Với chƣơng trình gradient dòng thích hợp cho pha động gồm metanol, acctonitrin, acid acetic 0,005 %, chế độ
25
quét chọn lọc ion (SIM) đã tách và định lƣợng đồng thời 15 hợp chất phenol và nhận danh chính xác các hợp chất phenol với giới hạn phát hiện thấp từ 10÷50 (ng/L). Phƣơng pháp sắc ký lỏng với đầu dò UV đã đƣợc sử dụng để xác định đồng thời các o–cresol, m–cresol, phenol, resorcinol, cathechol và hydroquinon trong nƣớc khi cho các hợp chất này tham gia phản ứng tạo dẫn xuất với enzoyl clorua trong vòng 15 phút. Các dẫn xuất Benzoyl đƣợc chiết ằng dung môi diethylether, sau đó đƣợc xác định ằng phƣơng pháp sắc ký lỏng pha đảo ở ƣớc sóng 232 nm với pha động gồm acetonitrin–tetrahydrofuran–nƣớc theo tỷ lệ 54:6:40 (v/v). Phƣơng pháp này cho phép xác định hàm lƣợng phenol trong rƣợu và nƣớc uống với giới hạn phát hiện từ 0,05÷0,50 (g/l), hiệu suất thu hồi trong khoảng 81÷94 (%) độ lặp lại của phƣơng pháp cao, thời gian phân tích ngắn.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng với đầu dò điện hóa là phƣơng pháp đang đƣợc phát triển để xác định phenol và các hợp chất của nó vì độ chọn lọc cao khả n ng oxi hóa hoặc khử của mỗi chất ở mỗi thế khác nhau. Phƣơng pháp này đơn giản, không đắt tiền nhƣng khó sử dụng, thời gian cân ằng rất dài, nhạy đối với tốc độ dòng và pH. Bề mặt điện cực dễ ị nhiễm ẩn nên cần hoạt hóa lại điện cực sau một thời gian ngắn sử dụng.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7874:2008 về Nƣớc - Xác định phenol và dẫn xuất của phenol - Phƣơng pháp sắc ký khi chiết lỏng-lỏng quy định quy định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng phenol và dẫn xuất của phenol trong nƣớc ằng phƣơng pháp sắc ký khí chiết lỏng-lỏng. Nguyên tắc của phƣơng pháp là acid hóa một thể tích mẫu xác định và chiết ằng metylen clorua. Làm khô phần chiết và chuyển sang dung môi 2-propanol trong quá trình cô đặc sau đó phân tích sắc ký khí xác định hàm lƣợng phenol và các dẫn xuất phenol. Phƣơng pháp này cũng quy định quy trình làm sạch cột sắc ký để loại ỏ các chất cản trở. Detector sử dụng xác định phenol là FID, các dẫn xuất của phenol sử dụng detector ẫy electron (ECD). Cột xác định phenol ằng thủy tinh dài 1,8 m, đƣờng kính trong 2 mm, đƣợc nhồi 1 % SP1240DA trên supelcoport (80/100 mesh) hoặc tƣơng đƣơng. Cột xác định các dẫn xuất phenol ằng thủy tinh dài 1,8 m, đƣờng kính trong 2 mm, đƣợc nhồi 5 % OV-
26
17 trên chromosor W-AW-DMCS (80/100 mesh) hoặc tƣơng đƣơng. Các cột này đƣợc sử dụng để xác định giới hạn phát hiện, các dữ liệu độ chụm và độ chệch trong tiêu chuẩn này [1].
1.5.2 Phương pháp cực phổ
Trong dung dịch nền CaCl2, với sự hiện diện của các cation kim loại nặng nhƣ chì và cadimi, hàm lƣợng các hợp chất nitrophenol, dinitrophenol và các dẫn xuất nitrophenol khác trong mẫu nƣớc sông và nƣớc thải công nghiệp đƣợc xác định đồng thời ằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân với điện cực thủy ngân. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là nhanh, độ nhạy cao, cho phép xác định đồng thời các kim loại nặng thƣờng hiện diện trong nƣớc thải. Tuy nhiên việc sử dụng điện cực thủy ngân độc hại là một hạn chế đáng kể của phƣơng pháp [2].
1.5.3 Phương pháp trắc quang
Phản ứng tạo màu đƣợc sử dụng rộng rãi trong phƣơng pháp phân tích quang phổ UV/VIS vì nó dễ dàng thực hiện, nhanh chóng, độ nhạy và độ chính xác cao có thể sử dụng trong các phòng thí nghiệm thông thƣờng với chi phí thấp [3]. Ở Việt Nam hiện có 2 phƣơng pháp trắc quang đƣợc quy định sử dụng là Tiêu chuẩn ngành 64 TCN 102:1997 - Xác định phenol trong nƣớc thải [4] và Tiêu chuẩn Việt nam TCVN 6216:1996 (ISO 6439: 1990) - Xác định chỉ số phenol trong nƣớc uống, nƣớc mặt và nƣớc thải [5].
Tiêu chuẩn ngành 64 TCN 102:1997 áp dụng để xác định hàm lƣợng phenol, các dẫn xuất và đồng đẳng của phenol trong nƣớc thải của các xí nghiệp sản xuất hoá chất, chế iến gỗ (chế tạo ván d m, ván sợi ép, gỗ dán...) và các xí nghiệp sản xuất có nƣớc thải chứa phenol và các dẫn xuất của phenol ằng phƣơng pháp đo màu sử dụng thuốc thử p-nitroanilin có hàm lƣợng phenol nhỏ (≤3 mg/L). Khi hàm lƣợng phenol lớn hơn 3mg/L cần pha loãng mẫu trƣớc khi phân tích. Nguyên tắc phƣơng pháp là tách phenol trong nƣớc thải khỏi nƣớc ằng cách cất trong môi trƣờng acid (acid sunfuric, acid photphoric) sau đó phần cất ra đƣợc kiềm hoá ằng dung dịch Na2CO3 5 % và cho tác dụng với dung dịch p-nitroanilin tạo ra phức màu xanh và
27
tiến hành đo màu ở ƣớc sóng 450 nm. Cƣờng độ màu của dung dịch tỷ lệ với hàm lƣợng của phenol trong mẫu nƣớc thải.
Tiêu chuẩn Việt nam TCVN 6216:1996 xác định phenol có trong trong nƣớc uống, nƣớc mặt và nƣớc thải. Nguyên tắc của phƣơng pháp là phenol hoặc các hợp chất phenol sau khi tách khỏi tạp ằng phƣơng pháp chƣng cất đƣợc cho phản ứng với 4- aminoantipyrin ở pH 10,0 ± 0,2 có mặt kali hexaxyanoferat Fe(CN)3 để tạo phức antipyrin màu vàng và đƣợc ly trích trong trong dịch CHCl3 sau đó đo độ hấp thụ màu ở ƣớc sóng 510 nm sử dụng chất chuẩn là phenol. Chiết ằng clorofom, có thể xác định chỉ số phenol khoảng từ 0,002 mg/L đến khoảng 0,10 mg/L. Ngoài ra có thể đo mẫu trực tiếp, giới hạn định lƣợng chỉ số phenol lớn hơn 0,1 mg/L.
Phƣơng pháp Folin-Ciocalteu: Trong phƣơng pháp này các polyphenol phản ứng oxy hóa với thuốc thử Folin-Ciocalteu là hỗn hợp axit photphotungstic (H3PW12O40) và phosphomoly dic (H3PMo12O40) trong môi trƣờng kiềm (Na2CO3) tạo thành các oxid màu xanh của tungstene (W8O23) và moly den (Mo8O23) có độ hấp thụ cực đại ở ƣớc sóng 765 nm. Acid gallic đƣợc sử dụng làm chất chuẩn. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định tổng số phenol của các polyphenol trong ngành dƣợc, thực phẩm hoặc trong các sản phẩm chiết xuất từ thảo dƣợc [6,7,8,9].
Phƣơng pháp Prussian Blue: N m 1977, Price và Butler đề xuất sử dụng hỗn hợp K3Fe(CN)6 và FeCl3 trong dung dịch HCl 0,1 N để đo màu xác định hàm lƣợng tổng polyphenol trong nguyên liệu thực vật. Polyphenol phản ứng với hỗn hợp thuốc thử tạo thành phức màu xanh có mật độ màu tỷ lệ thuận với lƣợng polyphenol. Phản ứng đƣợc thực hiện khi có dƣ Fe3+. N m 1980, Budini và cộng sự đã sửa đổi hiệu
28
chỉnh phƣơng pháp này và thƣờng đƣợc gọi là phƣơng pháp Prussian Blue dễ dàng, nhanh chóng, tiết kiệm và đƣợc sử dụng phổ iến. Polyphenol (PP) phản ứng với ion ferricyanide Fe(CN)63- và ị oxy hóa thành quinon trong khi Fe(CN)63- ị khử thành ion ferroyanua Fe(CN)64-. Ngay sau đó Fe(CN)64-
lại phản ứng với ion Fe3+ để tạo thành ferricyanua sắt Fe4[Fe(CN)6]3 có màu xanh thƣờng đƣợc gọi là Prussian lue. Curtman (1931) và Brown (1987) đã đề nghị cơ chế phản ứng oxy hóa khử ghép đôi này nhƣ sau [10].
Đã có nhiều công ố so sánh hai phƣơng pháp Folin-Ciocalteu và Prussian Blue trong việc xác định hàm lƣợng tổng các polyphenol có tác dụng kháng oxy hóa trong nƣớc ép trái cây, chè, …. Trong thực tế, cả hai phƣơng pháp đều có những ƣu điểm riêng trong việc xác định hàm lƣợng polyphenol. Phƣơng pháp Folin- Ciocalteu ổn định và có độ tin cậy cao. Phƣơng pháp Prussian-Blue đơn giản, nhanh hơn, đỡ tốn kém do sử dụng hóa chất rẻ tiền hơn ở nồng độ mmol và nhạy hơn do đó có thể phát hiện hàm lƣợng các polyphenol ở nồng độ thấp hơn 1.10–6 mg/mL. Tuy nhiên việc xử lý hỗn hợp thuốc thử K3Fe(CN)6 và FeCl3 là một yếu tố quan trọng trong phƣơng pháp và đòi hỏi tốn nhiều thời gian [11,12].
1.5.4 Phương pháp chuẩn độ
Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa trên phản ứng của phenol với rom đƣợc tạo ra ằng phản ứng của KBrO3 với KBr trong môi trƣờng acid (HCl, H2SO4). Sau đó chuẩn độ I2 đƣợc tạo ra từ phản ứng của KI với rom dƣ ằng dung dịch natri thiosunfat Na2S2O3 sử dụng chỉ thị hồ tinh ột. Phƣơng pháp này đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp nhƣng độ nhạy, độ chính xác không cao.
29 Br2 + 2KI = 2KBr + I2
I2 + 2Na2S2O3 → 2NaI + Na2S4O6
1.5.5 Phương pháp cảm biến sinh học
Bên cạnh các phƣơng pháp phân tích truyền thống, các cảm iến sinh học theo mô hình của D. Clark ao gồm các điện cực oxy hóa và các tác nhân sinh học nhƣ enzyme ứng dụng trong quan trắc phenol cũng thu hút sự chú ý của các nhà khoa học nhờ vào độ nhạy và độ chọn lọc cao. Tƣơng tác giữa thành phần sinh học và tác nhân cần phát hiện sẽ gây ra sự thay đổi các tín hiệu hoá-sinh, các tín hiệu này sẽ đƣợc truyền tải đến ề mặt điện cực thông qua các vật liệu án dẫn nhƣ polymer (polypyrrole, polyethylene), chitosan, alginate, hay các vật liệu nano mới nhƣ ống nano carbon, nanographene oxide, hạt nano vàng. Cụ thể hơn, trong trƣờng hợp phenol và các dẫn xuất đặc iệt là polyphenol, phản ứng oxi hóa nhóm hydroxyl (OH) của hợp chất phenol thành quinone đƣợc thực hiện trên ề mặt vật liệu nhờ xúc tác enzyme và đƣợc nhận iết ằng các kỹ thuật vật lý khác nhau nhƣ quang học, điện hóa, khối lƣợng, từ trƣờng. Tuy nhiên các thiết ị phân tích này có hạn chế là đòi hỏi nhiều kỹ n ng, cần các chuyên viên có kinh nghiệm, không thể phân tích ngoài hiện trƣờng do đó không đƣợc ứng dụng phổ iến trong hệ thống quan trắc môi trƣờng [13
,14].
1.5.6 Phương pháp oxy hóa
Tại Việt nam, đã có một số nghiên cứu khoa học về phát hiện và xử lý phenol trong nƣớc thải nhƣ nghiên cứu của tác giả Lê Tự Hải và cộng sự, đã nghiên cứu thành công quá trình xử lý phenol trong nƣớc ằng phƣơng pháp oxi hóa điện hóa trên điện cực P O2. Kết quả cho thấy rằng các yếu tố nhƣ pH dung dịch, nồng độ NaCl,
30
mật độ dòng, nồng độ phenol đều ảnh hƣởng đến hiệu suất quá trình oxy hoá phenol trên điện cực anôt P O2. Điều kiện để điện phân oxy hoá phenol đạt hiệu quả tốt nhất khi dung dịch điện ly Na2SO4 có nồng độ 0,15 M, pH là 8,0, nồng độ NaCl là 7,5 g.L-1, mật độ dòng i = 75 mA.cm-2
và điện cực anôt là P O2. Khi điện phân dung dịch phenol có nồng độ không vƣợt quá 1000 mg L-1 với điều kiện trên thì độ chuyển hoá của phenol đạt gần nhƣ hoàn toàn (> 98 %) và khả n ng khoáng hoá thành CO2 và H2O đạt trên 75 %. Sự có mặt ion Cl-
trong dung dịch đã làm t ng hiệu suất quá trình điện phân do sinh ra ClO- oxy hoá phenol theo cơ chế gián tiếp. Cấu trúc tế vi của điện cực P O2 hầu nhƣ không iến đổi sau khi điện phân oxy hoá phenol do đó có thể sử dụng P O2 làm điện cực anot để xử lý phenol trong nƣớc ằng phƣơng pháp điện hóa [15].
Phƣơng pháp đầu dò điện hóa đƣợc ứng dụng rộng rãi, đơn giản và rẻ tiền nhƣng ề mặt điện cực dễ ị nhiễm ẩn nên cần hoạt hóa lại sau một thời gian sử dụng. Với cùng phƣơng pháp nghiên cứu xác định các hợp chất phenol trong nƣớc ằng sắc ký lỏng- đầu dò điện hóa tác giả Nguyễn Thanh Bình Minh đã thành công trong việc phát hiện phenol ằng cách sử dụng sắc kí phân ố pha đảo với điện cực Glassy cacbon [16]. Tuy nhiên, tất cả các phƣơng pháp liên quan đến sắc kí và đầu dò đều đòi hỏi ngƣời phân tích phải có tay nghề chuyên môn cao, thiết ị đắt tiền, chi phí phân tích tốn kém và thời gian phân tích dài.
Tình hình nghiên cứu giấy chỉ thị màu sinh học sử dụng đầu dò tyrosynase và nanochitosan để xác định phenol trong nƣớc thải công nghiệp
Trong phƣơng pháp sử dụng tác nhân sinh học nhƣ một cảm iến hay một hệ thống cảnh áo sớm chất lƣợng nƣớc. tác giả Nông Minh Tuấn với đề tài nghiên cứu thiết ị pin nhiên liệu vi sinh vật (micro ial fuel cell) sử dụng làm cảm iến sinh học đánh giá chất lƣợng nƣớc thải. Pin nhiên liệu vi sinh vật là một dạng thiết ị cảm iến hoạt động dựa trên hoạt tính điện hóa của vi sinh vật. Tƣơng tác giữa thành phần sinh học và tác nhân cần phát hiện sẽ gây ra sự thay đổi các tín hiệu hoá-sinh, các tín hiệu này sẽ đƣợc truyền tải đến ề mặt điện cực thông qua các vật liệu án
31
dẫn nhƣ polymer (polypyrrole, polyethylene), chitosan, alginate, hay các vật liệu nano mới nhƣ ống nano car on, nanographene oxide, hạt nano vàng ... Phƣơng pháp này có ƣu điểm nhờ có khả n ng chỉ dẫn BOD nƣớc thải, có thời gian phản ứng nhanh, dễ dàng sử dụng, chi phí thấp [17
].
Cũng trong phƣơng pháp sử dụng tác nhân sinh học nhƣ một cảm iến hay một hệ thống cảnh áo sớm chất lƣợng nƣớc tác giả Trịnh Thị Thu Hằng và các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu chế tạo và ứng dụng điện cực tyrosine từ Aspergillus oryzae TP01. Kết quả cho thấy ở điều kiện thích hợp về nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất từ 10-7÷4.10-4 M (monophenol 10-7÷3.10-4 M; diphenol 10-6÷4.10-4 M) điện cực tyrosine có thể phát hiện nhanh 3 loại thuốc diệt cỏ antrazin, diuron, 2,4 D và các hợp chất phenol trong nƣớc thải của các nhà máy x ng dầu, hóa chất, thuốc lá, nhuộm, xà phòng [18].
Nhóm nghiên cứu của Arciuli đã nghiên cứu giấy chỉ thị màu cho phép phát hiện phenol trong rƣợu vang ằng cách cố định đơn giản enzyme tyrosinase trên giấy lọc kết hợp với chất chỉ thị màu 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) (Hình 1.8).
32