Amylopectin Amylose Enzyme phân nhánh Glucan phân nhánh Enzyme phân nhánh Bó amylopectin
17
Enzyme phân nhánh (1,4-α‐D‐glucan: 1,4-α‐D‐glucan 6-α‐D- (1,4‐α‐D‐glucano) transferase, EC2.4.1.18) là glucan transferase có nhiều trong thực vật và vi sinh vật. Chúng xúc tác các phản ứng chuyển để tạo thành các điểm nhánh α‐1,6 trong các cụm của amylopectin (3,5%) và glycogen (8% - 9%). Các enzyme này thường thuộc họ GH 13 [52,53]. Enzyme phân nhánh xúc tác quá trình chuyển liên kết α- 1,4-glucoside trong 1,4-α-D-glucan để tạo thành chuỗi maltooligosacarit (MOS) đầu không khử, sau đó được chuyển sang nhóm hydroxyl C-6 trong phản ứng không thể đảo ngược dẫn đến hình thành các nhánh α-1,6 trong α-1,4-polyglucans [54]. Các enzyme phân nhánh tách liên kết α‐1,4 trong phân tử và chuyển đoạn cuối không khử của chuỗi sang O6 của chuỗi glucan liên kết α‐1,4 khác đóng vai trò là chất nhận, làm hình thành của một chuỗi liên kết α‐1,6. Một số loại enzyme thương mại (Branchzyme® từ Novozyme, Đan Mạch) được sản xuất bằng cách lên men của chủng B. subtilis mang gen từ enzyme phân nhánh mã hóa R. obamensis có sẵn [55].
Bảng 1.1 Một số enzyme phân nhánh thương mại
Tên enzyme Thương hiệu Vi sinh vật sản xuất
Enzyme phân nhánh Branchzyme® Bacillus subilis
Maltogen amylase
Novamyl® Bacillus stearothermophilus
Amylax ™ Bacillus subilis
VERON® xTender Bacillus subilis
18
1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme phân nhánh
1.4.1 Ảnh hưởng của pH
Enzyme bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi của pH. Giá trị pH thuận lợi nhất mà tại đó enzyme hoạt động mạnh nhất được gọi là giá trị pH tối ưu. Các giá trị pH quá cao hoặc quá thấp thường làm mất hoạt tính hoàn toàn của hầu hết các enzyme. Giá trị pH cũng là một yếu tố tạo nên sự ổn định của các enzyme. Mỗi enzyme cũng có một vùng cấu trúc ổn định ở pH tối ưu. Các enzyme thuộc nhóm amylase thường có pH tối ưu nằm trong khoảng 6,0 - 7,0 (riêng amylase có nguồn gốc từ đại mạch có pH tối ưu là 4,6 - 5,2).
Tất cả các protein đều lưỡng tính, tính chất này phụ thuộc vào pH của môi trường, các nhóm acid hoặc base của enzyme đều có khả năng ion hóa. Khi pH môi trường thay đổi sẽ xảy ra liên kết với H+ hay OH-. Do đó, mức độ ion của các amino acid trong trung tâm hoạt động của enzyme thay đổi thì sự tạo thành liên kết giữa enzyme-cơ chất sẽ bị ức chế và do đó ảnh hưởng tới quá trình thủy phân [56].
1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh huởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Giống như hầu hết các phản ứng hóa học, tốc độ của một phản ứng được xúc tác bởi enzyme tăng lên khi nhiệt độ tăng. Nhiệt độ tăng 10ºC sẽ làm tăng hoạt động của hầu hết các enzyme từ 50 - 100%. Sự thay đổi nhiệt độ phản ứng nhỏ chỉ từ 1 - 2ºC có thể làm thay đổi hiệu suất phản ứng từ 10 - 20%. Tốc độ enzyme chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định, vượt quá giới hạn đó tốc độ enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu [57]. Nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản ứng đạt cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu. Nhiệt độ mà tại đó enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính là nhiệt độ tới hạn.
Do enzyme có bản chất protein nên khi nhiệt độ thủy phân vượt qua nhiệt độ giới hạn của enzyme đó thì vận tốc phản ứng sẽ giảm do sự biến tính của enzyme. Trong khoảng nhiệt độ mà enzyme chưa bị biến tính thì hệ số truyền nhiệt của đa số enzyme khoảng 1,4 - 2. Khi bắt đầu có sự biến tính enzyme thì xảy ra hiện tượng: một mặt vận tốc phản ứng vẫn tăng theo sự gia tăng nhiệt độ, mặt khác tốc độ biến tính enzyme cũng nhanh hơn. Kết quả là tốc độ phản ứng giảm dần đến ngưng hoàn
19
toàn. Đối với các enzyme phân nhánh như maltogenic amylase có khả năng chịu nhiệt cao hơn so với enzyme thông thường (nhiệt độ phản ứng tối ưu của MAase chịu nhiệt từ Thermus sp. strain IM6501 là 60°C khi β-cyclodextrin được sử dụng làm chất nền trong natri 50 mM acetate buffer pH 6,0) [58].
1.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất ảnh hưởng đến tốc độ chính và năng suất của quá trình thủy phân bằng enzyme. Nồng độ cơ chất cao có thể dẫn đến ức chế cơ chất, làm giảm đáng kể tốc độ thủy phân. Nồng độ cơ chất sẽ ảnh hưởng đến các vấn đề liên quan đến giảm nhiệt và hiệu suất truyền khối, các vấn đề về lưu biến và tăng nồng độ chất ức chế [59].
Năm 1913, Michaelis và Menten đã đề ra giả thuyết về vai trò của nồng độ cơ chất trong việc hình thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) (Hình 1.2).
Hình 1.3 Đồ thị Michaelis - Menten về sự tương quan giữa tốc độ phản ứng và nồng độ cơ chất
(Với Km = hằng số Michaelis của enzyme đối vối cơ chất)
Khi nồng độ cơ chất thấp hơn KM rất nhiều, nghĩa là với số lượng enzym vượt quá số lượng cơ chất, trong phương trình Michaelis-Menten, ta có thể bỏ [S] ở mẫu số, phương trình trở thành dạng v=Vmax [S]/ KM, đây là phương trình tuyến tính dạng y =
20
ax, nghĩa là tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất [S]. Lúc này phản ứng là phản ứng động học bậc 1 bởi vì tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất tăng lên đến mức đạt giá trị bằng giá trị KM thì phương trình Michaelis-Menten trở thành dạng V = Vmax/2, có nghĩa là tốc độ phản ứng bằng 1/2 tốc độ tối đa.
Khi nồng độ cơ chất lớn hơn KM rất nhiều thì ta có thể bở KM ở mẫu số của phương trình Michaelis-Menten, và phương trình trở thành dạng V = Vmax, có nghĩa là tốc độ phản ứng đạt tốc độ tối đa (Vmax). Lúc này tất cả các phân tử enzyme đều bão hoà cơ chất, phản ứng đạt động học “bậc không”, bởi vì, dù có tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng không thay đổi và lúc này tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ enzyme.
Trong điều kiện nồng độ cơ chất thích hợp thì vận tốc phản ứng tuyến tính với nồng độ enzyme. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme tăng đến một giới hạn thì tốc độ phản ứng không tăng lên nữa [60]. Giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thừa, vận tốc phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme, hàm luợng chất khô hòa tan tăng. Càng về sau sản phẩm tạo thành tăng lên, vừa đóng vai trò chất ức chế không cạnh tranh, vừa làm cho luợng cơ chất trong môi truờng giảm nên khi tiếp tục tăng nồng dộ enzyme thì vận tốc phản ứng tăng không đáng kể.
1.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Nồng độ của enzyme rất quan trọng trong phản ứng hóa học vì nó cần thiết để phản ứng với cơ chất. Thông thường, một lượng nhỏ enzyme có thể phân giải một lượng lớn cơ chất. Khi tăng nồng độ enzyme thì hiệu quả cũng tăng lên. Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng, cơ chất phải có một lượng dư thừa, nghĩa là phản ứng phải độc lập với nồng độ cơ chất. Bất kỳ sự thay đổi nào về lượng sản phẩm được tạo thành trong một khoảng thời gian nhất định sẽ phụ thuộc vào mức độ có mặt của enzyme. Lượng enzyme có trong một phản ứng được đo bằng hoạt động mà nó xúc tác.
21
Mối quan hệ giữa hoạt độ và nồng độ bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH,... Một thử nghiệm enzyme phải được thiết kế sao cho hoạt tính quan sát được tỷ lệ thuận với lượng enzyme có mặt để nồng độ enzyme là yếu tố giới hạn duy nhất. Những phản ứng này được cho là "phản ứng bậc 0" vì tốc độ không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Việc hình thành sản phẩm diễn ra với tốc độ tuyến tính với thời gian. Việc bổ sung thêm chất nền không giúp tăng tỷ lệ phản ứng [61]. Sự thủy phân tinh bột là tổng các tác dụng của các enzyme chứa trong mầm thóc, nấm mốc hoặc vi khuẩn. Mỗi hệ amylase đều có số lượng và hoạt độ khác nhau của từng enzyme. Khi tăng hoạt độ enzyme thì tốc độ thủy phân tinh bột sẽ tăng và tỷ lệ với lượng enzyme đưa vào nhưng chỉ trong giai đoạn đầu khi bậc phản ứng bằng 0. Tùy vào chất lượng của chế phẩm amylase, tỷ lệ này có thể khác nhau và dao động trong khoảng khá lớn. Tỷ lệ này cũng không cố định mà giảm dần theo trình độ công nghệ đạt được trong sản xuất chế phẩm enzyme.
1.4.5 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Tất cả các enzyme đều có thời gian phản ứng tối ưu để hiển thị hoạt tính xúc tác tối đa của nó. Trong sản xuất việc xác định được thời gian thủy phân hợp lý có ý nghĩa quan trọng về mặt kỹ thuật. Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme gồm nhiều giai đoạn. Ban dầu cơ chất bị thủy phân tạo lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh. Sau đó các dextrin này bị phân cách tiếp tục tạo các mạch ngắn dần và bị phân giải chậm dến glucose và maltose [57].
1.5 Phương pháp tinh sạch enzyme mục tiêu
Trong dịch chiết enzyme thô thu được ngoài protein mục tiêu còn lẫn các tạp chất khác trong quá trình tách chiết (protein tạp, polysaccharide, nucleic acid, lipid, muối khoáng v.v...). Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, các phương pháp khác nhau được kết hợp như biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, tủa phân đoạn bằng, sắc ký, điện di,…
22
1.5.1 Phương pháp sắc ký
Thuật ngữ “sắc ký” lần đầu được sử dụng bởi nhà khoa học người Nga Mikhail Tsvet vào năm 1900 để mô tả hiện tượng hỗn hợp các sắc tố được mang theo bởi một dung môi để di chuyển trên giấy và tách ra khỏi nhau. Sắc ký bao gồm hai pha pha động và pha tĩnh. Pha động điều khiển các hợp chất chảy qua bề mặt của pha tĩnh và sự di chuyển của các hợp chất bị chậm lại do tương tác với pha tĩnh. Các chất nền khác nhau tùy thuộc vào tương tác và cuối cùng được tách ra. Pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn được gọi là sắc ký lỏng và được sử dụng rộng rãi trong việc tách các hợp chất nhỏ hoặc các đại phân tử sinh học.
Các kỹ thuật khác nhau tách protein tùy thuộc vào các tính chất khác nhau bao gồm điện tích bề mặt, tính kỵ nước, kích thước phân tử và tương tác ái lực. Trong đó, sắc ký ái lực là kỹ thuật sắc ký nhanh và hiệu quả. Hoạt tính sinh học đặc hiệu cao mang lại cho sắc ký ái lực độ chọn lọc cực cao, nhờ đó protein hoặc một nhóm protein có thể được tách ra khỏi mẫu thô trong một bước và đạt đến độ tinh khiết. Tuy nhiên, những khó khăn trong việc thu nhận và cố định phối tử phù hợp, kỹ thuật sắc ký này không được sử dụng rộng rãi như các kỹ thuật khác.
Sắc ký ái lực đề cập đến một loạt các kỹ thuật tách protein trên cơ sở tương tác thuận nghịch giữa các protein và các phối tử cụ thể của chúng kết hợp với một chất nền [62]. Các tương tác ái lực bắt nguồn từ một loạt các phản ứng sinh học, gồm các tương tác giữa enzyme và các chất tương tự cơ chất, chất ức chế, cofactors, kháng thể và kháng nguyên, thụ thể và kháng nguyên màng, nucleic acid và trình tự bổ sung, histones, hoặc nucleic acid polymerase, protein liên kết nucleic acid, phân tử nhỏ sinh học và các thụ thể hoặc protein vận chuyển, ion kim loại và protein có trình tự polyhistidine.
Tương tác ái lực là kết quả của sự kết hợp các loại tương tác khác nhau, bao gồm tương tác tĩnh điện, tương tác kỵ nước, lực van der Vaals hoặc liên kết hydro. Các tương tác có độ đặc hiệu cao luôn cung cấp độ chọn lọc cực cao, nhờ đó protein mục tiêu có thể dễ dàng tách ra trong một bước với độ tinh khiết tăng hàng nghìn
23
lần và độ thu hồi cao. Sắc ký ái lực tách protein thông thường trên cơ sở tương tác giữa các phối tử và vùng domain của protein đích. Các tương tác không bị can thiệp bởi các vùng khác trong hầu hết các trường hợp. Đầu tiên, protein đích được biểu hiện là protein gắn đuôi ở dạng dung hợp. Sau đó, protein mục tiêu được tinh chế bằng cách sử dụng cột ái lực dành riêng cho protein gắn đuôi. Nếu cần phải loại bỏ đuôi, protease hạn chế được sử dụng để thủy phân protein và giải phóng đuôi His, tách chúng ra khỏi protein mục tiêu bằng cách đi qua lại cột. Các protein gắn đuôi dung hợp thường được sử dụng là His tag, GST tag, FLAG tag, S tag, Strep tag,…[63].
* Sắc ký ái lực kim loại cố định Ni-NTA
Hình 1.4 Liên kết ái lực của đuôi 6xHis với Ni2+
Trong quá trình tạo dòng, protein tái tổ hợp được gắn đuôi polyHistidine (his-tag) ở cuối đầu N hoặc C để tạo điều kiện cho tinh sạch và phát hiện. Khi cho hỗn hợp protein tái tổ hợp đi qua cột sắc ký có chứa một phối tử liên kết đặc hiệu với các protein mang đuôi ái lực His. His-tag thường gồm 6 histidine, có thể được đặt ở nhóm amino cuối hoặc nhóm carboxyl cuối của protein, nơi chức năng của protein ít bị suy giảm nhất. Do có kích thước nhỏ (0,84 kDa ở hexahistidine) và không tích điện ở pH sinh lý bình thường, his-tag thường không ảnh hưởng đến việc gấp cuộn của protein. Phương pháp tinh chế này được sử dụng trong các trường hợp không can thiệp đến cấu trúc hoặc chức năng của protein tái tổ hợp [64].
24
Ion kim loại được sử dụng phổ biến nhất cho IMAC là Ni2+ do có ái lực cao với protein tái tổ hợp có đuôi 6xHis, trong khi hầu hết các protein khác sẽ liên kết với ái lực thấp hoặc hoàn toàn không liên kết. Trong một số trường hợp có thể sử dụng các ion kim loại khác, ví dụ là Zn2+, Co2+,… vì ái lực gắn còn phụ thuộc vào bản chất của protein có đuôi histidine. Khi đưa dịch chiết protein qua cột sắc ký chứa các ion Ni2+, các ion này liên kết chọn lọc với đuôi histidine (Hình 1.3), những protein có đuôi histidine sẽ được giữ lại, sử dụng dung dịch đệm rửa có nồng độ imidazole thấp, rửa giải các protein nào liên kết yếu với cột nickel. Sau đó thực hiện quá trình rửa protein có gắn his-tag bằng cách cho imidazole nồng độ cao đi qua cột. Các phương pháp rửa giải khác bao gồm giảm độ pH, để histidine bị proton hóa và không còn có ái lực với nickel, hoặc sử dụng các tác nhân tạo chelate mạnh như EDTA và EGTA [64].
Thông thường, imidazole được thêm vào cả ba dung dịch đệm là binding buffer, washing buffer và elution buffer để can thiệp đến liên kết yếu của các không phải protein đích với cột và để rửa giải protein liên kết yếu đó. Ở nồng độ cao hơn, imidazole cũng có thể làm giảm sự gắn kết của protein được gắn đuôi histidine. Do đó nồng độ imidazole phải được tối ưu hóa để đảm bảo độ tinh khiết cao và năng suất cao. Các protein được gắn đuôi histidine khác nhau có nồng độ tối ưu là khác nhau (Histrap guide book).
1.5.2 Thẩm tích
Trong quá trình tích chiết protein và nucleic acid, thường còn sót lại các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như DTT, 2-mercaptoethanol, biotin,… hoặc chất bảo quản như natri azide, thimerosol, các chất này có thể gây ảnh hưởng đến bước tiếp theo trong quy trình thí nghiệm, hoặc muốn đổi hệ thống đệm khác cho mẫu protein để chuẩn bị cho điện di, trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực thì người ta thường sử dụng phương pháp thẩm tích. Đây là kỹ thuật loại bỏ các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ, không mong muốn khỏi mẫu trong dung dịch bằng cách khuếch tán chọn lọc và thụ động qua màng bán thấm. Mẫu và dung dịch đệm (dung dịch thẩm tích,