Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. Cơ sở sinh lý và cơ chế bảo vệ tế bào của tiền thích nghi
1.5.1. Định nghĩa tiền thích nghi
Tiền thích nghi là bảo vệ tế bào chống lại thiếu oxy gián tiếp qua một giai đoạn thiếu máu ngắn không đe doạ tính mạng [11], [42], [45], [81], [91].
Cơ chế phân tử của bảo vệ tế bào cực kì phức tạp, ngoài thiếu máu thì nhiều thuốc mê nhƣ thuốc mê hô hấp và thuốc họ morphine có thể tạo ra hay thay đổi dòng thác tín hiệu phản ứng khác nhau liên quan đến bảo vệ tế bào khỏi tổn thƣơng do thiếu oxy. Thuật ngữ trên đƣợc gọi là tiền thích nghi bằng thuốc mê [30], [32], [37],[41], [128], [129].
Nhiều nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra cơ chế phân tử và sinh học cụ thể liên quan đến dung nạp của tế bào với thiếu oxy cấp và mãn. Tình trạng thiếu oxy mô hay gặp trong những bệnh nguy hiểm và thƣờng thấy gần đây. Đây là tình trạng rối loạn cung cấp oxy tế bào, cung không đáp ứng đủ nhu cầu chuyển hoá của tế bào [11], [42], [45], [94], [95].
1.5.2. Cơ chế phân tử của tiền thích nghi bằng thiếu máu và tiền thích nghi bằng thuốc mê
Tiền thích nghi thiếu máu có liên quan đến 2 dạng bảo vệ, cửa sổ đầu tiên kéo dài khoảng 2-3 giờ sau thiếu máu đã đƣợc tiền thích nghi và cửa sổ thứ hai của bảo vệ xảy ra 1 ngày sau thiếu máu và kéo dài 2-3 ngày.
- Bệnh học của tiền thích nghi thiếu máu - vai trò của ty thể
Ty thể là nơi quá trình sinh hoá học liên quan đến sống chết tế bào trong điều kiện chuyển hóa yếm khí. Tất cả những thay đổi chuyển hóa và sinh hóa học chính đều hoạt hoá con đƣờng dẫn truyền tín hiệu gây kích thích đáp ứng nhân với tổn thƣơng oxy hoá. Trong nhiều năm qua, đã chứng minh đƣợc rằng ―phần nhận cảm oxy‖ (oxygen sensor) có liên quan đến đáp ứng ty thể với thiếu oxy mãn và cấp. Có nhiều bằng chứng gợi ý phức hợp men vận chuyển electron ty thể (ETC - electron transport enzyme complexes) nhƣ là đích đặc trƣng của sự hiện diện phân tử oxy thấp. Oxy hóa cytochrome C cung cấp electron từ cytochrome đến oxy là dễ thích ứng với các hình thái chức năng với thay đổi nồng độ oxy. Đầu tiên, giảm oxy ức chế chuỗi vận chuyển electron trong màng ty thể. Kết quả, thiếu oxy ức chế vận chuyển proton và do đó gây giảm điện thế màng. Kết quả cuối cùng là giảm tổng hợp ATP, với tăng tính thấm màng ty thể và giải phóng Ca++ và cytochrome C thông qua hoạt hoá protein Bax hay Bak. Cơ chế này hoạt hoá men caspases liên quan đến quá trình chết tế bào. Trái với tác dụng chết tế bào của thiếu oxy, tế bào có thể đề kháng với chết tế bào trong quá trình thiếu oxy. Ngƣời ta cho rằng sự dịch chuyển protein Bax chết tế bào đến ty thể bị ức chế. Cùng lúc đó, thiếu oxy qua việc tạo ROS hoạt hoá yếu tố giải mã NF-kB tạo ra protein bổ sung ―chất ức chế huỷ chết tế bào protein 2‖ (IPA-2: inhibitor of apotosis protein 2).
Mặc dù những cơ chế tổn thƣơng tế bào trên, các giai đoạn thiếu oxy ngắn (3-5 phút) và lặp đi lặp lại kích thích đáp ứng thích nghi với thiếu oxy tế bào. Kích thích oxy hoá và tăng nồng độ Ca++trong suốt quá trình thiếu và hoặc thiếu máu kích thích tạo NO nội mô, đặc biệt trong cửa sổ bảo vệ thứ 2 (tiền thích nghi trễ). Do tính chất khí của NO, nó sẽ khuếch tán vào ty thể của tế bào và gắn để tạo dạng giảm cytochrome a3. Điều này xảy ra cùng một vị trí và cùng dạng men với gắn oxy. Kết quả là hoạt động oxy hoá của cytochrome bị ức chế trong khi sự ức chế này cạnh tranh với oxy và hồi phục khi hồi phục nồng độ oxy. Tóm lại, thiếu oxy tạo NO và ức chế một phần cytochrome dẫn đến đáp ứng trao đổi chất của men đến sự hiện diện phân tử oxy thấp. Cơ chế này đƣợc xem nhƣ là yếu tố giới hạn trong việc tạo ROS ty thể do thiếu oxy. Cùng lúc đó có cơ chế điều hoà ngƣợc của Na/K ATPase hoạt động để chống lại tình trạng giảm năng lƣợng. Giảm mức độ lớn trong Na/K ATPase hoạt động không làm thay đổi sự chênh lệch điện hoá học do giảm đồng thời tính thấm màng tế bào [70], [74], [79], [82].
Ngoài tạo NO, tiền thích nghi thiếu máu còn giải phóng adenosine nucleotide trong tƣơng bào với kích thích thụ thể adenosine A1. Adenosin và NO giữ vai trò quan trọng trong chuyển dịch và hoạt hoá protein kinase C (PCK) màng, đặc biệt trong cửa sổ thứ 2 của tiền thích nghi. Trong giai đoạn không hoạt hoá này, PKC chỉ liên kết lỏng lẻo với lipid màng. Hoạt hoá PKC gây ổn định màng. Trong suốt giai đoạn thiếu máu, tất cả các yếu tố gây tổn thƣơng (tạo chất oxy hoá, thiếu ATP, quá tải Ca++
) hoạt hoá đồng vị PKC và gây phosphoryl hoá nhóm serine và threonine trong kênh protein màng ty thể dẫn đến hoạt hoá kênh K+ATP (ATP sensitive potassium channels), kênh giữ vai trò quan trọng trong thích nghi của tế bào với tình trạng thiếu oxy. Hoạt hoá kênh K+ATP ty thể và màng bào cơ tạo điện thế hoạt động ngắn (ADP- action potential duration) giúp giảm hấp thu Ca++ một cách đáng kể và giảm
quá tải Ca++ ty thể. Ngày càng có nhiều bằng chứng về tạo NO do thiếu oxy gây mở kênh K+ATP [70], [74], [79], [82].
- Biến đổi gen: HIF-1 và những yếu tố khác
Cơ chế khác của thích nghi tế bào với thiếu oxy gồm những thay đổi chức năng chuyển hoá vĩnh viễn thông qua thành phần điều hoà gen khác nhau. Yếu tố điều hoà cân bằng oxy ý nghĩa nhất là hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1). Hoạt động của nó đƣợc tạo ra do thiếu oxy trong tất cả các loại nhân tế bào thông qua cơ chế lý thuyết sau giải mã và giữ vai trò quan trọng trong đáp ứng của hệ thống tim mạch và hô hấp với thiếu oxy [89], [94], [112].
HIF-1 là phức hợp protein gồm tiểu đơn vị HIF-1α và HIF-1β. HIF-1α điều hoà hoạt động sao chép của nhiều gen liên quan đến tạo thành mạch và tái cấu trúc mạch máu, tạo hồng cầu, chuyển hoá, chết tế bào, kiểm soát ROS, hoạt động vận mạch và trƣơng lực mạch máu, hiện tƣợng viêm. HIF-1α làm thay đổi sao chép của những gen này bằng nhị trùng hoá với aryl hydrocarbon nuclear translocase (ARNT hoặc HIF -1β) và sau đó gắn với yếu tố đáp ứng thiếu oxy chuyên biệt (specific hypoxia response elements: HREs) tại vùng điều hoà của chúng. Đáp ứng cuối cùng là hoạt hoá sự sao chép. Trong điều kiện oxy bình thƣờng, HIF-1α trải qua pro-pyl-hydroxyl tạo ra vị trí gắn kết đƣợc nhận biết bởi von Hippel-Lindau protein (VHL). VHL là một tiểu đơn vị trong phức hợp E3 ubiquitin ligase mà polybiquitilates HIF-1α, do đó nhắm mục tiêu nó cho hủy nhanh bởi proteosome. Khi thiếu oxy, propyl-hydroxyl không xảy ra do đó VHL không gắn với HIF-1α. Kết quả, HIF-1α liên quan đến ARNT, gắn HRE vào gen đáp ứng với thiếu oxy và gây biến đổi sự sao chép của chúng. HIF-1α có thể gây ra chết tế bào bằng cách ổn định sản phẩm của gen ức chế u. Protein này gây chết tế bào do điều hoà hoạt động của protein. Tuy nhiên, ngoài gây chết tế bào còn gây hoại tử tế bào đƣợc tạo ra
do thiếu oxy, kết quả của tạo NF-kB. Đã có bằng chứng về hoạt động thiếu oxy thông qua con đƣờng tín hiệu chung đƣợc sử dụng bởi TNF và IL-1. Cả hai cytokin này truyền tính hiệu thông qua sphingomyelin (SM)-ceramide, tại đó ceramide đƣợc tạo ra từ màng SM với hoạt hoá kinases và phospholipases, và cuối cùng hoạt hoá NF-kB. Những yếu tố dẫn đến sao chép gen đích mà mã hoá các cytokine tiền viêm (IL-6 và IL-8, TNF-α). Cùng lúc đó, NF-kB ức chế quá trình chết tế bào qua sự quá mức của yếu tố kháng chết tế bào BCL-2 [99], [104].
- Cơ chế của tiền thích nghi với thuốc mê
Có nhiều bằng chứng ủng hộ tác dụng tiền thích nghi của thuốc mê hô hấp, đặc biệt ở mô tim bên cạnh những thuốc mê khác. Isoflurane đã đƣợc chứng minh là giảm kích thƣớc ổ nhồi máu trong tổn thƣơng cơ tim ở chó in vivo. Những nghiên cứu khác cũng đã chứng minh isoflurane có tác dụng tiền thích nghi ở cơ tim ngƣời và thỏ trong khi halothane chỉ có tác dụng tiền thích nghi ở cơ tim của thỏ. Có vẻ là tiền thích nghi với thiếu máu và tiền thích nghi với thuốc mê có cùng cơ chế sinh lý bệnh. Toller và cs đã chỉ ra rằng kênh K+ATP ty thể và màng bao cơ giữ vai trò quan trọng trong tiền thích nghi gây ra do desflurane thông qua sự thay đổi Ca++ ty thể và tạo ROS. Ức chế chất kháng thụ thể adenosin A2 và ức chế PCK là cơ chế bảo vệ tim của thuốc mê hô hấp. Ngoài ra, tiền kích thích do isoflurane có liên quan đến hoạt hoá protein Gi qua ức chế Ca++ vào tƣơng bào và giảm nồng độ cAMP. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho rằng kích thích thụ thể α1 qua trung gian tiền thích nghi với thiếu máu hay tiền thích nghi với desflurane ở cơ tim đặc biệt trƣớc giai đoạn thiếu máu, bởi vì desflurane gây giải phóng nguồn dự trữ các catecholamine nội sinh ở cơ tim chuột và ngƣời. Sử dụng chip AND, Lucchinetti và cs đã nghiên cứu sự biến đổi sao chép ở cơ tim chuột đƣợc tƣới máu cách ly sau khi đƣợc cho thiếu máu 40 phút, sau đó là tái tƣới máu 3 giờ
lập trong điều kiện đã đƣợc tiền thích nghi với thuốc mê (gây mê với isoflurane 2.1% trong 15 phút sau đó ngƣng 10 phút). Tác giả nhận thấy HIF- 1, NF-kB và phức hợp I và III của ty thể đƣợc điều hoà giảm, trong khi tăng đáng kể sự hiện diện uncoupling protein (UCP) trong màng ty thể bỏ qua giai đoạn tạo ATP. Cơ chế này có thể là cách để giảm tạo ROS qua không kết nối trao đổi khí tại phức hợp I và III và gây ra những chất bảo vệ chống oxy hoá. Cũng có thể thực hiện tiền thích nghi với isoflurane bằng cách cung cấp isoflurane 2,1% 15 phút trƣớc khi bắt đầu tái tƣới máu gây tăng protein co cơ và các protein khe tiếp hợp (connexins 32, 36 và 40), giảm đáp ứng viêm qua cơ chế giảm điều hòa cytokine, chemokine và phân tử kết dính. Những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng thuốc mê hô hấp làm giảm tổng hợp iNOS (inducible nitric oxide synthase), bảo vệ cơ tim khỏi tổn thƣơng ROS bằng cách ức chế tƣơng tác của chúng với NO và những sản phẩm sau của sự peroxynitrate các gốc tự do. Cùng lúc đó, giảm đáng kể chết tế bào cơ tim do tổng hợp qua mức yếu tố chống chết tế bào BCL-2 [119], [120], [143], [154].
Ngoài thuốc mê hô hấp, các thuốc họ morphine cũng có tác dụng tiền thích nghi. Các thụ thể morphine có ở tế bào cơ tim, do đó đồng vận thuốc họ morphine có tác dụng bảo vệ cơ tim qua 2 cơ chế: (1) tăng sản xuất inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) dẫn đến thiếu dự trữ canxi của lƣới cơ tƣơng làm giảm tích tụ canxi giai đoạn thiếu máu; (2) Hoạt hoá PKC bằng diacylglycerol tạo ra bằng thuỷ phân màng phosphorlipids kết hợp với IP3 và sau đó mở kênh K+ATP qua trung gian. Sử dụng morphine trƣớc giai đoạn thiếu máu có tác dụng giống tiền thích nghi trong khi đó naloxon ức chế tác dụng này [119], [120], [143], [154].
1.5.3. Các phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan
Đánh giá tổn thƣơng tế bào gan do hiện tƣợng thiếu máu và tái tƣới máu có thể dựa vào đánh giá gián tiếp qua chỉ dấu sinh học là nồng độ đỉnh ALT,
AST, nồng độ GDH (glutamate dehydrogenase), IL1 [18], [21], [36], [116] hoặc các xét nghiệm nhƣ sinh thiết mô để đánh giá chết tế bào hoặc các xét nghiệm khác nhƣ: iNOS, caspase-3, caspase-8 [19], [85].
Nồng độ đỉnh của ALT, AST đƣợc nhiều tác giả lựa chọn làm biến số để đánh giá mức độ tổn thƣơng tế bào gan trong các phẫu thuật cắt gan cũng nhƣ đƣợc lựa chọn làm tiêu chí nghiên cứu chính để đánh giá mức độ tổn thƣơng tế bào gan do thiếu máu – tái tƣới máu trong phẫu thuật cắt gan có kiểm soát mạch máu [7], [8], [9], [17], [35], [38], [54]. Tại Việt Nam, với thời điểm bắt đầu nghiên cứu vào năm 2014 thì phƣơng pháp đánh giá tổn thƣơng tế bào gan khả thi nhất là xét nghiệm nồng độ đỉnh của ALT, AST sau mổ. Do đó chúng tôi chọn chỉ dấu sinh học là nồng độ đỉnh của ALT, AST để đánh giá tổn thƣơng tế bào gan trong nghiên cứu này.