3.2.1. Kết quả khảo sát biểu hiện của các gien tạo sụn bằng qRT-PCR
Trong suốt quá trình cảm ứng biệt hĩa tạo sụn, TBGTM cĩ sự thay đổi sự biểu hiện các gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2 sau 7, 14 và 21 ngày cảm ứng biệt hĩa.
Hình 3.6. Sự biểu hiện các gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2 khi cảm ứng biệt hĩa tạo sụn
Sự biểu hiện của sox9 tại mốc ngày 7, 14 và 21 đều cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05), tuy nhiên khi đánh giá sự biểu hiện giữa các mốc thời gian với nhau thì khơng thấy cĩ sự khác biệt rõ rệt. Kết quả này cũng ghi nhận tương tự với các gien col2a1, col1a2 và colX.
Sự tăng biểu hiện của gien sox9 trong nhĩm được biệt hĩa tạo sụn cao nhất vào ngày thứ 7, gấp 61,39 ± 4,96 (p< 0,05) lần so với nhĩm chứng khơng biệt hĩa tạo sụn. Sự biểu hiện của sox9 đến ngày thứ 14 sụt giảm cịn 28,8 ± 16,3 (p<0,05) và tăng lại vào ngày thứ 21 là 42,07 ± 12,86 lần (p<0,05).
Gien col1a2 ghi nhận sự tăng biểu hiện trong nhĩm biệt hĩa tạo sụn cao nhất vào ngày thứ 7, gấp 6,09 ± 0,13 lần (p<0,05) so với nhĩm khơng biệt hĩa và giảm dần vào ngày thứ 14 và 21 lần lượt là 2,46 ± 1,97 và 2,13 ± 1,23 lần (p<0,05).
Gien col2a1 ghi nhận sự tăng biểu hiện cao nhất vào ngày thứ 14, gấp 4,5 ± 1,87 lần (p<0,05) so với nhĩm chứng, vào ngày 7 và ngày 21 lần lượt là 3,08 ± 1,18 và 3,26 ± 0,95 lần (p<0,05).
Kết quả sự biểu hiện gien acan bắt đầu ghi nhận thấy rõ từ ngày 7 và đạt cao nhất vào ngày thứ 21, gấp 57,15 ± 22,52 lần so với nhĩm chứng (p<0,05), vào ngày 7 và ngày 14 lần lượt 8,63 ± 3,67 và 30,58 ± 21,66 lần (p<0,05).
Kết quả sự biểu hiện gien của colX ghi nhận bắt đầu biểu hiện vào ngày 7, và đạt tăng đến ngày 14 và ngày 21. Trong đĩ, sự biểu hiện gien của colX tại ngày 14 cao gấp 1,77 ± 0,54 (p<0,05) và khơng thay đổi khi đánh giá tại ngày 21.
Đối với gien runX2, sự biểu hiện gien bắt đầu thấy rõ từ ngày 7, cao gấp 4,06 ± 1,01 lần so với nhĩm chứng (p<0,05) và tăng cao nhất tại ngày 14.
3.2.2. Kết quả thu nhận giá thể màng chân bì da người
Phần chân bì từ da người sau khi được tách khỏi thượng bì và hạ bì theo quy trình đã thiết lập [4] và sẽ tiến hành nhuộm mơ học để đánh giá cấu trúc phần collagen thu được.
A
B
C
D
E
Hình 3.7. Kết quả thu nhận giá thể màng chân bì da người
(A). Mẫu da người được nhuộm H-SG (×10), trước khi được xử lý để thu nhận giá thể màng chân bì. (B) và (C). Kết quả loại bỏ phần thượng bì, thu nhận phần chân bì, được nhuộm H-SG, chụp lần lượt ở các vật kính (×10) và (×20). (D) và (E). Thu nhận phần giá thể màng chân bì sau khi hồn tất quy trình, được nhuộm H-SG, chụp lần lượt ở các vật kính (×10) và (×20).
Đánh giá khả năng gây độc tế bào của giá thể màng chân bì
Giá thể màng chân bì được ngâm trong chai nuơi đang nuơi cấy TBGTM để đánh giá khả năng gây độc cĩ thể cĩ của vật liệu (màng chân bì) đối với tế bào đang phát triển, thí nghiệm này dựa theo tiêu chuẩn ISO 10993-5. Kết quả theo dõi trong vịng 24 – 48 giờ nuơi cấy, kết quả đánh giá được thể hiện trong hình 3.8.
A B
Hình 3.8. Kết quả đánh giá độc tính của màng chân bì đối với TBGTM trong vịng 48 giờ nuơi cấy
(A) và (B). Hai màng chân bì được ngâm trong chai nuơi cĩ chứa nguyên bào sợi (mũi tên màu vàng), được chụp dưới kính hiển vi đảo ngược ở độ phĩng đại ×100 và ×200. màng chân bì (tam giác màu vàng) cho thấy khơng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của TBGTM, hay nĩi cách khác màng chân bì này khơng gây độc đối với tế bào.
Tiếp tục đánh giá khả năng gây độc của màng chân bì sau thu nhận đối với tế bào, nhĩm nghiên cứu sử dụng màng chân bì để nuơi các TBGTM và theo dõi trong vịng 1 tuần nuơi cấy. Kết quả đánh giá được thể hiện trong hình 3.9.
A B
C Hình 3.9. Kết quả nuơi cấy TBGTM trên màng chân bì.
(A) và (B). Kết quả nuơi cấy TBGTM trên màng chân bì được nhuộm H-SG, được quan sát ở độ phĩng đại ×100 và ×200. Cấu trúc của màng chân bì cho thấy khơng cĩ sự biến đổi so với ban đầu, cĩ sự hiện diện của tế bào bên trong màng chân bì. (C). Các TBGTM hiện diện trong màng chân bì bắt màu hồng đậm (mũi tên đỏ), bám vào các hốc hoặc bên trong các nhánh collagen (độ phĩng đại ×400).
3.2.3. Kết quả tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp của TBGTM và màng chân bì
Phương pháp chuyển tế bào lên màng chân bì được tiến hành như mơ tả ở phần thiết kế nghiên cứu mục 2.3.3.3. Vào ngày thứ 7 và thứ 14 sau biệt hĩa, lớp TBGTM sẽ được chuyển lên giá thể màng chân bì.
A B C
Hình 3.10. Kết quả chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 7 sau biệt hĩa tạo sụn
(A). Lớp TBGTM sau biệt hĩa tạo sụn 7 ngày (độ phĩng đại x40), (B). Lớp TBGTM sau biệt hĩa tạo sụn được nhuộm Alcian Blue để đánh giá hiệu quả tạo sụn (độ phĩng đại x100), (C). Màng chân bì được cuộn quanh bởi lớp TBGTM biệt hĩa sụn 7 ngày (độ phĩng đại x40).
A B
Hình 3.11. Kết quả chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 14 sau biệt hĩa tạo sụn
(A). Màng chân bì sau khi được cuộn 2 lần bởi lớp TBGTM biệt hĩa sụn ngày thứ 14 (độ phĩng đại x100), (B). Lớp TBGTM hiện diện ở xung quanh và xâm nhập vào bên trong kết cấu collagen của màng chân bì (độ phĩng đại x100), (C). Lớp TBGTM bám phía ngồi rìa màng chân bì (độ phĩng đại x400).
Kết quả nghiên cứu theo dõi nuơi cấy dưới kính hiển vi đảo ngược ở hình 3.10 và 3.11 cho thấy, các tế bào sụn đã bám dính và tăng trưởng khá tốt trên màng chân bì. Giá thể màng chân bì cho thấy cĩ đặc tính rất phù hợp cho các tế bào sụn bám dính và
phát triển vì cĩ những đặc điểm thuận lợi để tạo giá thể nuơi cấy tế bào như đặc tính khơng gây độc tế bào, cấu trúc lỗ liên thơng giúp tế bào cĩ thể dễ dàng tăng trưởng. Trên hình ảnh mơ học nhuộm HE (Hình 3.12) ghi nhận lớp TBGTM tăng sinh, tạo một lớp tế bào dày xung quanh giá thể màng chân bì, đồng thời cĩ hiện diện tế bào len lõi trong các hốc trống của mạng lưới collagen.
x100 x400
Hình 3.12. Cấu trúc mơ học nhuộm H&E của tấm tế bào sụn được cuộn TBGTM 2 lần
Tấm tế bào sụn nhuộm HE quan sát ở độ phĩng đại x100 và x400 cho thấy tế bào biệt hĩa được đưa lên giá thể hiện diện trong các khoảng trống của lớp chân bì và xung quanh giá thể cĩ lớp tế bào rất dày bao phủ, bám chặt vào giá thể.
3.2.4. Kết quả đánh giá một số đặc điểm của tấm tế bào sụn được tạo bằng mơ học và SEM
Tấm tế bào sụn được tạo ra sẽ lần lượt được mang đi nhuộm mơ học và chụp SEM để khảo sát cấu trúc.
3.2.4.1. Kết quả nhuộm mơ học
A B
C D
Hình 3.13. Cấu trúc mơ học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào sụn sau khi chuyển TBGTM 1 lần.
(A), (B) Tấm tế bào sụn nhuộm HE quan sát ở độ phĩng đại x200 và x400, cho thấy bên trong xuất hiện rất nhiều tế bào sụn (mũi tên màu đen). (C), (D) Tấm tế bào sụn nhuộm Safranin O quan sát ở độ phĩng đại x200 và x400, kết quả nhuộm cho thấy các tế bào sụn bắt màu đỏ cam sáng màu (mũi tên màu vàng), phân bố trong giá thể collagen.
A
C
B
D
Hình 3.14. Cấu trúc mơ học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào sụn sau khi chuyển TBGTM 2 lần.
(A), (B) Tấm tế bào sụn nhuộm HE quan sát ở độ phĩng đại x200 và x400, cho thấy bên trong xuất hiện rất nhiều tế bào sụn (mũi tên màu đen). (C), (D) Tấm tế bào sụn nhuộm Safranin O quan sát ở độ phĩng đại x200 và x400, kết quả nhuộm cho thấy các tế bào sụn bắt màu đỏ cam sáng màu (mũi tên màu xanh), phân bố đều khắp trong giá thể collagen.
Trên tiêu bản nhuộm H&E và nhuộm Safranin – O đều cho thấy cĩ sự hiện diện tế bào, hình thái tế bào thay đổi từ thon dài chuyển sang đa diện và xung quanh tế bào bắt đầu hình thành các hốc trống giống như hình thái tế bào sụn trong mơ sụn (rất khác biệt với hình thái thon dài của TBGTM). Các tế bào sụn phát triển và phân bố khá đều trong mảnh ghép, điều này rất hợp lý vì màng chân bì cĩ cấu trúc liên thơng nên hỗ trợ sự di chuyển và phát triển của tế bào bên trong tấm tế bào sụn. Khi phân tích cấu trúc mơ học của tấm tế bào sụn được chuyển tế bào 1 lần (hình 3.13) với được chuyển tế
bào 2 lần (hình 3.14) ghi nhận tấm tế bào sụn được chuyển TBGTM 2 lần tạo được lớp tế bào dày hơn, tế bào hiện diện trong các hốc của mạng lưới collagen nhiều và chất nền sụn tạo ra cũng nhiều hơn.
Trên kết quả mơ học cũng cho thấy màng chân bì khơng cịn cấu trúc xốp ban đầu của giá thể (hình 3.7), điều này chứng tỏ các tế bào sụn trong quá trình tăng trưởng đã tạo ra các chất nền sụn xung quanh và hình thành các hốc chứa tế bào bên trong. Điều này rất quan trọng để tạo ra được tấm tế bào sụn cĩ mang các tế bào sụn hoạt động, cĩ thể triển khai ứng dụng ghép thay thế tổn thương bề mặt mơ sụn trên lâm sàng sau này. Từ kết quả nhuộm mơ học cho thấy tấm tế bào sụn được tạo thành chứa hồn tồn là tế bào sụn được biệt hĩa từ TBGTM.
3.2.4.2. Kết quả khảo sát dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Ngồi ra, sử dụng kỹ thuật chụp SEM để đánh giá kết quả tạo tấm tế bào sụn cho thấy, các tế bào sụn bám dính và lan tỏa rất tốt trên bề mặt màng chân bì (hình 3.15).
Hình 3.15. Tấm tế bào sụn quan sát dưới KHV điện tử quét (SEM)
(A). Giá thể màng chân bì (chứng âm), khơng cĩ nuơi tế bào. (B). Kết quả tạo tấm tế bào sụn, các tế bào sụn phát triển và tăng trưởng rất nhiều bám vào các khung collagen trong giá thể (x200). (C). Kết quả chụp (x500), các tế bào bám dính và tăng
trưởng trên bề mặt giá thể (mũi tên). (D). Kết quả chụp (x1000), cho thấy rất rõ các tế bào bám dính và phân chia xung quanh các cấu trúc collagen.