Tiến hành thí nghiệm với điều kiện HPLC đã chọn để định lợng vitamin D. Tiêm dung môi pha mẫu là methanol thu đợc sắc đồ của mẫu trắng (Hình 2.9), lấy độ lớn của nhiễu lớn nhất tại thời gian lu của vitamin D là khoảng 10 phút (lấy từ 9 đến 11 phút) có pic nhiễu lớn nhất với diện tích khoảng 0,5
Thay giá trị Y = 0,5 vào phơng trình hồi quy Y = 1,539X – 0,898
Ta tính đợc X0 = (0,5 + 0,898)/1,539 = 2,59 UI/ml Hiệu suất chiết đã khảo sát là 97,2 %, nên X sẽ là X = 2,59/97,2x100 = 2,66 UI/ml
- Giới hạn phát hiện đợc tính bằng 3 lần độ lớn của nhiễu
LOD = 2,66x3 = 7,99 UI/ml;
- Giới hạn định lợng đợc tính bằng 10 lần độ lớn của nhiễu
LOQ = 2,66x10 = 26,6 UI/ml
Sau đó tiến hành thí nghiệm tiếp tục: Pha dung dịch vitamin D chuẩn trong methanol có nồng độ bằng giới hạn định lợng, tiến hành đo diện tích pic của dung dịch này 5 lần, tính độ lặp lại RSD của diện tích pic, kết quả nh sau:
Bảng 2.11. Kết quả khảo sát giới hạn định lợng
STT Diện tích pic Giá trị thống kê độ lặp lại
1 40,040 Tb = 39,932 RSD = 2,406 % 2 39,252 3 38,954 4 41,420 5 40,013
Với nồng độ vitamin D 26,6 UI/ml, kết quả đo độ lặp lại chấp nhận đợc. Vì vậy LOQ = 26.6 UI/ml là giới hạn định lợng của phơng pháp định lợng vitamin D
2.3. Bàn luận.
SPE là một kỹ thuật chiết có nhiều u điểm. Ta có thể sử dụng kỹ thuật này để làm sạch và làm giàu mẫu. Điều này rất quan trọng với các chất có hàm lợng rất nhỏ trong một hỗn hợp đa thành phần. SPE có thể thay thế cho HPLC trong việc tinh chế các chất.
Để tinh chế một mẫu vitamin D theo quy trình trên ta chỉ cần 11ml methanol, 5ml acetonitril, 10 ml hexan, trong khi nếu sử dụng chiết lỏng- lỏng hoặc HPLC để tinh chế thì lợng dung môi tốn hơn nhiều.
Các giai đoạn tiến hành khá đơn giản, hoạt chất không chịu nhiều tác động nên hạn chế đợc mất mát. Điều này rất quan trọng nhất là với các chất không bền, dễ bị phân hủy.
Hơn nữa cột SPE có giá thành không cao, có thể hồi phục để dùng lại nhiều lần. Để sử dụng lại cột phải lu ý rửa thật sạch cột sau khi chiết. Trong mẫu syro Patarvit, sau khi rửă giải đợc vitamin D thì trong cột vẫn còn vitamin A (Hình 2.6 cho thấy thời gian lu của vitamin A rất lớn). Nếu ta không loại hoàn toàn vitamin A thì ở lần chiết sau vitamin A sẽ ra sớm và lẫn vào dịch rửa giải.
Hiện nay, bên cạnh dợc phẩm, các thực phẩm có bổ xung vitamin D xuất hiện ngày càng nhiều. Đó là những mẫu rất phức tạp trong đó hàm lợng vitamin D thờng rất thấp. Trong trờng hợp này có thể dùng SPE để tinh chế mẫu trớc khi phân tích.
Hình 2.10: Sắc ký đồ mẫu chuẩn vitamin A (200 UI.ml), Cột C18 (250 mm x 4 mm, 5 àm), tốc độ 1,5 ml/phút
Phần 3
Kết luận và đề xuất
3.1. Kết luận.
Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã thu đợc những kết quả sau: - Biết cách tiến hành nghiên cứu và hoàn thiện một đề tài, biết cách tra cứu và tìm hiểu tài liệu tham khảo phục vụ cho quá trình thực hiện một đề tài nghiên cứu khoa học.
- Rèn luyện tác phong và phơng pháp nghiên cứu khoa học.
- Xây dựng đợc quy trình chiết vitamin D cho mẫu syro thuốc.
- Hiểu đợc cơ sở lý thuyết của sắc ký lỏng hiệu năng cao và chiết pha rắn - Biết vận hành và sử dụng một số thiết bị hiện đại trong kiểm nghiệm thuốc.
- Xây dựng đợc chơng trình sắc ký để định lợng vitamin D nh sau: + Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
+ Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 5 và 10àm) + Detector UV đặt ở bớc sóng 265 nm.
+ Pha động: methanol- ethyl acetat- nớc (90: 7: 3). + Tốc độ dòng 1,5 ml/phút.
+ Thể tích mẫu tiêm: 20àm. + Nhiệt độ phòng.
- ứng dụng quy trình chiết và chơng trình sắc ký đã xây dựng để định lợng vitamin trong syro thuốc Patarvit.
3.2.Đề xuất.
Sau khi thực hiện khoá luận này, em xin đề xuất một số ý kiến sau:
- Kính mong nhà trờng và các bộ môn tạo điều kiện cho sinh viên đợc tiếp cận và thực hành nhiều hơn với những máy móc hiện đại nh máy đo quang phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lợng vitamin D trong một số dạng bào chế khác của thuốc multivitamin và trong thực phẩm có bổ xung vitamin D.
- ứng dụng chiết pha rắn để tinh chế các chất có hàm lợng rất nhỏ trong một hỗn hợp phức tạp.