2.2.1.9 .Biểu hiện gen P450-T2
2.2.2.2. Điện di SDS-PAGE
Điện di SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli[60]. Gel được chuẩn bị làm 2 pha.
Pha 1 (pha phân tách) được chuẩn bị thành phần như sau:
Dung dịch gốc Nồng độ acrylamid cuối cùng10%
4xLT (1.5M Tris/Cl, pH 8.8; 0.4% SDS) 3,75 ml
10% APS 75 µl
dH2O Bổ sung 15 ml
30% bis acrylamide 5 ml
Hỗn hợp thành phần pha 1 được đổ cẩn thận vào khoảng giữa 2 lớp kính. Bổ sung nước cất đến tràn mặt kính và chờ quá trình polymer hĩa gel ở nhiệt độ phịng. Loại bỏ lớp nước phía trên để đổ pha 2 (pha gom) lên phía trên bản gel. Pha 2 được chuẩn bị như sau:
Dung dịch gốc Nồng độ bis acrylamide 5%
4xUT (0.5M Tris/Cl, pH 6.8; 0.4% SDS) 2,5 ml
10% APS 50 µl
dH2O Bổ sung 10 ml
30% bis acrylamide 1,6 ml
TEMED 5 µl
Ngay sau khi đổ pha 2 vào giữa 2 lớp kính cần phải gắn lược ngay để tránh tình trạng bị đơng gel. Các bản gel được rửa sạch, bảo quản trong giấy thấm nước và giữ ở 4oC cho đến khi sử dụng
Một phần của mẫu protein được trộn với đệm 2xSDS (125 mM Tris/Cl, pH 6,8; 20% glycerol; 4% SDS; 10% β-mercaptoethanol; 0.004% bromphenol blue) với tỉ lệ 1:1 (v/v) và đun ở 100oC trong 5 phút. Mẫu được tra trên bản gel sau khi tháo lược. Quá trình chạy điện di SDS-PAGE được thực hiện ở 80 V trong 15 phút, sau đĩ nâng điện thế lên 100 V cho đến khi vạch chỉ thị của bromophenol blue chạm vào giới hạn đáy của bản gel.
Sau khi chạy điện di, bản gel được tháo rời khỏi hai lớp kính và được nhuộm với dung dịch nhuộm xanh coomasie (0.1% Coomassie Brilliant Blue G-250; 40% Methanol; 10% Acetic acid) trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng. Quá trình tẩy màu sau đĩ được thực hiện với dung dịch tẩy (25% Methanol; 10% Acetic acid) 2-3 lần cho đến khi nhìn rõ các vạch protein trên bản gel. Bản gel cuối cùng được làm khơ bằng máy Model 583 gel dryer (BioRad) nhằm bảo quản.