Để kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu cũng như khả năng phỏt hiện cỏc đoạn axit nucleic đặc hiệu của vi rỳt HSV, chỳng tụi sử dụng bộ khuyếch đại Lock-in SR830.
+ Bộ khuếch đại Lock-in SR830
Bộ khuếch đại Lock-in SR830 dựng để phỏt hiện và đo tớn hiệu xoay chiều rất nhỏ, với điện ỏp cỡ vài nano vụn. Phộp đo được thực hiện chớnh xỏc ngay cả khi tớn hiệu nhỏ bị nhiễu bởi cỏc nguồn nhiễu khỏc lớn hơn hàng nghỡn lần.
Bộ khuếch đại sử dụng độ nhạy pha để phỏt hiện tớn hiệu ra, đõy là thành phần
đơn lẻ trong số cỏc thành phần của tớn hiệu tại tần số và pha chuẩn riờng biệt. Tớn hiệu nhiễu tại tần số khỏc với tần số chuẩn đặc trưng được loại bỏ và khụng ảnh hưởng đến phộp đo. Sig Ref Tín hiệu chuẩn Tín hiệu hình sin Tín hiệu từ Lock-in Hỡnh 2.10 Dạng súng từ bộ khuếch đại Lock-in
Bộ khuếch đại SR830 phỏt ra súng hỡnh sin cú dạng chuẩn lock-in (lock-in reference) là: VLsin(ωLt + θref). Tớn hiệu này sau đú được khuếch đại bởi bộ phỏt hiện
độ nhạy pha hoặc bộ nhõn. Đầu ra của bộ phỏt hiện độ nhạy pha này là hai súng hỡnh sin.
Vpsd = VsigVLsin(ωrt + θsig)sinωLt + θref) (2.7) = 1/2 VsigVLcos([ωr - ωL]t + θsig - θref)
-1/2 VsigVLcos([ωr + ωL]t + θsig + θref) (2.8)
Đú là hai tớn hiệu xoay chiều, cú tần số tại (ωr - ωL) và (ωr + ωL). Nếu đầu ra của bộ phỏt hiện độ nhạy pha được cho qua bộ lọc tần thấp, tớn hiệu xoay chiều cú tần số cao được loại bỏ. Tuy nhiờn, nếu ωr bằng ωL thỡ thành phần hiệu hai tần số sẽ là tớn hiệu một chiều. Trong trường hợp này, đầu ra của hệ phỏt hiện độ nhạy pha được đưa qua bộ lọc sẽ là Vpsd = 1/2 VsigVLcos(θsig - θref). Đõy là tớn hiệu một chiều tỷ lệ với tớn hiệu khuếch đại.
+ Phương phỏp đo
Khi cú sự lai hoỏ giữa cỏc chuỗi DNA đớch với DNA đầu dũ được cốđịnh trờn bề mặt vi cảm biến sẽ tạo sự thay đổi mật độ điện tớch trờn bề mặt màng polymer dẫn. Lỳc này, vựng điện cực chỉ phủ APTS sẽ đúng vai trũ là điện cực so sỏnh, cũn điện cực phủ APTS gắn DNA đúng vai trũ là điện cực hoạt động sẽ cú giỏ trị chờnh lệch về độ dẫn so với điện cực so sỏnh này. Từđú, ta xỏc định được sự phụ thuộc giữa nồng
độ của DNA và sự chờnh lệch vềđộ dẫn giữa hai vựngg vi điện cực.
Sự chờnh lệch độ dẫn giữa hai vựng vi điện cực này được đưa vào mỏy Lock- in SR830 để xử lý (lọc nhiễu, so sỏnh, khuếch đại) và hiển thị ra kết quả dưới dạng
điện ỏp.
+) Cỏch bố trớ hệđo
Quỏ trỡnh đo này sẽ được mụ tả ngắn gọn như sau: Tớn hiệu chuẩn của dũng xoay chiều cú tần số 10 KHz và biờn độ 100 mV được lấy từ bộ khuếch đại Lock-in SR830, kớch thớch lờn hai vi điện cực. Tớn hiệu ra lỳc này được đặt trờn hai điện trở
Hỡnh 2.11. Hệđo vi sai sử dụng mỏy khuyếch đại Lock-in SR830
+) Nguyờn lý đo
Từ cỏch bố trớ hệđo như trờn, ta cú thể vẽđược mạch tương đương của hệđo vi sai như hỡnh 2.11.
Hỡnh 2.12. Mạch tương đương của hệđo vi sai
Với:
S: Tớn hiệu so sỏnh từ bộ phỏt với điện ỏp V = 100mV. Rout: Điện trở ngoài, Rout = 1KΩ.
R: Điện trở của màng polyme dẫn. G: Vụn kế (Điện ỏp ra (Vout) được hiển thị). Vin ~ VA out B ● R (1K) R (1K) Điện cực so sỏnh Điện cực hoạt động Mẫu phõn tớch
Khi đú dũng điện của hệđo được xỏc định bởi cụng thức dưới đõy: out R R V I + = (2.9) Mặt khỏc: out out R V I = (2.10) Từ (2.9) và (2.10) ta cú: out out out R V V V R + = (2.11) Độ dẫn được tớnh theo cụng thức: R G= 1 (2.12) Từ (2.11), (2.12) độ dẫn của màng polyme dẫn cú dạng:
(V Voutout)Rout V R G + = = 1 (2.13) Do, V >> Vout (V = 100 mV, Vout ~ mV ), khi đú ta cú:
out out R V V G . = (2.14) Hay: ( ) 100 10 10 1 3 V S x V G = − out − = out (2.15) Hoặc: ( ) 100 S V G Δ out = Δ (2.16) Như vậy, ở đõy tần số khụng được đo bởi nú tỏc động trực tiếp đến màng polyme dẫn và được biểu diễn bởi giỏ trị điện ỏp ra (Vout).
+ Thực hiện cỏc phộp đo
Pha loóng mẫu phõn tớch chứa DNA bổ sung cú trỡnh tự 5’-G TCC CTC TCC GGG TCG GTG AT-3’ trong nước cú enzyme bảo vệ axit nucleic tới nồng độ nM.
Sau khi đó nối vi cảm biến với đầu vào của bộ khuếch đại Lock-in. Cỏc phộp đo
- Nhỳng vi cảm biến đó cố định DNA đầu dũ vào trong cốc thuỷ tinh chứa 1ml nước khử ion đặt trong hệ gia nhiệt cú thể thay đổi nhiệt độ.
- Mẫu phõn tớch cú nồng độ khỏc nhau được nhỏ vào trong cốc tuỳ theo phộp đo nhằm xỏc định khả năng bắt cặp của DNA đầu dũ và DNA đớch trờn bề mặt vi cảm biến theo nồng độ, thời gian và nhiệt độ. Tớn hiệu được thể hiện bằng sự
chờnh lệch thếđầu ra giữa điện cực so sỏnh và điện cực hoạt động.
Đối với sản phẩm PCR của HSV cũng được pha loóng tới nồng độ nM. Sau đú nõng nhiệt độ lờn 95°C trong khoảng 5 phỳt để tỏch hoàn DNA sợi đụi của HSV thành cỏc sợi đơn, rồi hạ nhanh nhiệt độ xuống khoảng 50 – 55°C và thực hiện đo đạc với vi cảm biến, quỏ trỡnh này nhằm tạo ra sự lai húa thành cỏc DNA sợi đụi trờn bề mặt cảm biến. Đo tớn hiệu theo thời gian trờn bộ Lock in SR830. Tất cả cỏc phộp đo đều được thực hiện trong tuýp nhựa (hoặc cốc thủy tinh) chứa 1ml nước khử ion. Những mẫu cũn lại được cất giữa ở 4°C chờ thực hiện cỏc phộp đo tiếp theo.
Để khẳng định độ nhạy và tớnh đặc hiệu của vi cảm biến sinh học DNA trong việc phỏt hiện axit nucleic của vi rỳt HSV, vi cảm biến cũng được đo đạc với mẫu phõn tớch chỉ cú nước khử ion.
Cỏc bước đo cú thể khỏi quỏt theo hàm 2.15:
) , , (C T t f Vout = (2.15) Trong đú C là nồng độ chất phõn tớch, T là nhiệt độđo và t là thời gian ghi nhận sự lai húa, Vout là tớn hiệu thếđầu ra tương ứng.
+ Xõy dựng bảng mẫu để thực hiện và tổng hợp cỏc kết quả cỏc phộp đo
Để thuận tiện cho quỏ trỡnh đo đạc và kiểm tra cỏc thụng số của vi cảm biến DNA, tỏc giả đó xõy dựng bảng mẫu chuẩn để ghi nhận tớn hiệu thếđầu ra tương ứng với sự thay đổi của nồng độ chất phõn tớch, nhiệt độ và thời gian.
Bảng 2.4. Bảng mẫu thực hiện cỏc phộp đo theo nồng độ, nhiệt độ, thời gian C1 [nM] ……… Cx[nM] Cđớch ; t V ; T t1 [phỳt] … tq t1 …. tq t1 … tq T1 V111 … V11q … … … Vx11 …. Vx1q ….. …. … …. …. …. … …. …. …. Vout [mV] Tp V1p1 ... V1pq …. …. … Vxp1 …. Vxpq
Trong bảng 2.4, Cx là nồng độ mẫu phõn tớch cú thể pha loóng cỡ nM và thay
đổi từ nồng độ nhỏ nhất (C1 = Cmin) để thấy tớn hiệu lai húa đến xấp xỉ nồng độ DNA
đầu dũ (Cđầu dũ) (do sự mất mỏt DNA đầu dũ trong quỏ trỡnh cốđịnh lờn bề mặt vi cảm biến nờn chỉ đo nồng độ mẫu phõn tớch xấp xỉ nồng độ DNA đầu dũ). Nhiệt độ phản
ứng Tp thay đổi từ nhiệt độ phũng T1 = Tphũngđến giỏ trị lớn hơn nhiệt độ biến tớnh Tm
(tớn hiệu lai húa sụt giảm). Trong quỏ trỡnh đo đạc, việc nõng nhiệt độ nờn quỏ Tm là cần thiết để xỏc định được giỏ trị nhiệt độ biến tớnh giữa DNA đầu dũ và DNA đớch bằng thực nghiệm. Ứng với mỗi nồng độ chất phõn tớch, cỏc giỏ trị chờnh lệch thế ở đầu ra (Vout) được ghi lại theo thời gian t [phỳt], tớnh từ thời gian đỏp ứng tương ứng với quỏ trỡnh xuất hiện sự lai húa đến thời điểm tớn hiệu đầu ra đạt giỏ trị ổn định (tương ứng với sự lai húa bóo hũa).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trong chương 2, quỏ trỡnh thực nghiệm đó được mụ tả chi tiết, tương ứng với quỏ trỡnh này, tỏc giả sẽ trỡnh bày kết quả đạt được và bàn luận xung quanh những kết quảđú.
3.1 Cảm biến vi điện cực
Trong giai đoạn đầu thực hiện đề tài, trờn cơ sở thiết kế cảm biến vi điện cực trước đõy của nhúm nghiờn cứu về cảm biến sinh học tại ITIMS, tỏc giả cựng nhúm nghiờn cứu đó chế tạo bộ cảm biến vi điện cực 30àm x 70àm để ỏp dụng cho mục đớch của đề tài. Hỡnh 3.1A là hỡnh ảnh của một cảm biến vi điện cực, cú chiều dài 26mm, chiều rộng 6mm, bao gồm hai vựng điện cực, trong đú một trong hai vựng sẽđúng vai trũ là điện cực hoạt động, vựng cũn lại đúng vai trũ nhưđiện cực so sỏnh. Hỡnh 3.1B là hỡnh ảnh chụp dưới hiển vi điện tử quột phúng đại một vựng điện cực Pt cú cấu trỳc kiểu răng lược đan xen nhau. Độ rộng của mỗi bản điện cực là 70àm, khoảng cỏch giữa hai điện cực liờn tiếp là 30àm. Diện tớch vựng điện cực hoạt động là 1,4mm x 1,1mm.
Hỡnh 3.1A. Vi cảm biến 30àm x 70àm sau khi đó cắt ra từ phiến silic với hai vựng
điện cực được thiết kế song song
Hỡnh 3.1B. Vựng điện cực hoạt động của vi cảm biến 30àm x 70àm chụp dưới kớnh hiển vi điện tử quột Với loại cảm biến 30àm x 70àm, thể tớch mẫu phõn tớch phải đủ lớn để nhỳng ngập hai vựng điện cực hoạt động và so sỏnh, hệđo cồng kềnh hơn và tớn hiệu đầu ra ớt ổn định hơn so với loại vi cảm biến thế hệ mới. Mặt khỏc, do nồng độ mẫu phõn tớch thường rất thấp nờn phải pha loóng mẫu gấp nhiều lần. Khoảng cỏch giữa hai vi điện cực kế nhau là 30àm dẫn đến sự trao đổi của những ion mang điện giữa cỏc vi điện
cực bị hạn chế, sự thay đổi tớn hiệu điện ỏp đầu ra khi cú sự lai húa giữa DNA đầu dũ và DNA đớch xuất hiện nhanh ngay sau khoảng 1 phỳt, nhưng thời gian đạt đến trạng thỏi ổn định lõu (~ 10 phỳt) với nồng độ mẫu phõn tớch cỡ 0,5nM. Một số kết quả thử
nghiệm về khả năng ứng dụng của loại vi cảm biến này trong nghiờn cứu y sinh học đó
được tỏc giả cụng bố tại Hội nghị quốc tế về kỹ thuật y sinh học lần thứ 2, Hà Nội - 2007 [29] và Hội nghị toàn quốc về những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống năm 2007, Qui Nhơn - Bỡnh Định [4].
Để tăng độ nhạy và thớch hợp hơn đối với mẫu phõn tớch cú nồng độ thấp như
DNA/RNA của cỏc loại vi rỳt gõy bệnh, nhúm nghiờn cứu của chỳng tụi đó thiết kếđể
chế tạo ra loại vi cảm biến thế hệ mới 20àm x 20àm với cỏc tớnh năng ưu việt hơn so với thế hệ cũ trờn cơ cở những điều kiện về vật chất và trang thiết bị thớ nghiệm của ITIMS - Trường Đại học Bỏch khoa Hà Nội. Loại vi cảm biến thế hệ mới này cú kớch thước thu gọn hơn (dài x rộng = 10mm x 3,5mm), nhưng diện tớch vựng điện cực hoạt
động lại lớn hơn (1,6mm x 1,5mm), vựng điện cực hoạt động và so sỏnh được thiết kế
theo kiểu trờn - dưới thuận lợi hơn cho quỏ trỡnh cốđịnh phần tử DNA đầu dũ và phõn tớch mẫu và ưu điểm nổi trội nhất chớnh là khoảng cỏch giữa cỏc vi điện cực được thu hẹp lại cũn 20àm so với phiờn bản cũ khiến cho sự tương tỏc qua lại của cỏc ion mang
điện trở nờn dễ dàng hơn giữa cỏc vi điện cực, từ đú sự thay đổi độ dẫn biểu hiện rừ ràng hơn ngay cả khi cú tương tỏc rất nhỏ của cỏc phần tửđầu dũ và phần tửđớch trờn bề mặt vi cảm biến (hỡnh 3.2A; 3.2B).
Hỡnh 3.2A. Vi cảm biến loại 20àm x 20àm, chiều dài tổng khoảng 10mm, chiều rộng 0,4cm, cú hai vựng điện cực được thiết kế theo kiểu trờn - dưới
Hỡnh 3.2B. Vựng điện cực hoạt động vi cảm biến 20àm x 20àm, cỏc vi điện cực được thiết kếđan xen nhau trong diện tớch 1,6mm x 1,5mm
Bảng 3.1 cho thấy rừ được những đặc tớnh ưu việt cũng như những khú khăn gặp phải giữa hai loại vi cảm biến đó được tỏc giả ứng dụng trong quỏ trỡnh nghiờn cứu.
Bảng 3.1. So sỏnh ưu, nhược điểm của hai loại cảm biến vi điện cực
Cỏc thụng số của cảm biến vi điện
cực Phiờn bản cũ Phiờn bản mới
Đường kớnh phiến silic sử dụng 76,2 mm 101,6mm Kớch thước vi cảm biến (dài x rộng) 26mm x 6mm 10mm x 3,5mm Độ rộng bản điện cực x khoảng cỏch 70àm x 30àm 20àm x 20àm Diện tớch vựng điện cực hoạt động 1,4mm x 1,1 mm 1,6 mm x 1,5mm Sốđiện cực trờn vựng điện cực hoạt động 14 40 Cỏc bố trớ điện cực so sỏnhvà điện cực
hoạt động Song song Trờn - dưới
Giao tiếp với mạch đo Chõn cắm PCI Hàn dõy dựng siờu õm trờn mạch in Thể tớch dung dịch mẫu phõn tớch cần
thiết >1ml ≤1ml
Thao tỏc thực nghiệm Dễ Khú hơn
3.2 Tạo màng polyme dẫn APTS
Trong nghiờn cứu này, tỏc giả đó ỏp dụng phương phỏp húa học để tạo lớp màng mỏng polyme dẫn APTS trờn bề mặt vi cảm biến. Quỏ trỡnh thực nghiệm được mụ tả chi tiết trong chương II, mục 2.2.3. Sau khi tổng hợp màng bằng cỏch ngõm trong dung dịch dung dịch APTS : cồn tuyệt đối với tỷ lệ thể tớch tương ứng 3 : 7 trong 60 phỳt, vi cảm biến được đưa ra ngoài và để khụ trong khụng khớ 15 phỳt để kiểm tra tớnh đồng nhất và khả năng bao phủ của màng tổng APTS hợp được bằng HVĐTQ S- 4800, Hitachi. Hỡnh ảnh hiển vi điện tử quột cho thấy những hạt polyme dẫn khỏ đồng
đều về kớch thước cỡ 45-50nm, sắp xếp đều đặn, bao phủ toàn bộ bề mặt vi cảm biến (hỡnh 3.3). Sự đồng nhất của màng polyme dẫn đảm bảo cho quỏ trỡnh truyền dẫn những ion mang điện giữa cỏc vi điện cực diễn ra một cỏch thuận lợi hơn. Do đú, chỉ
một tương tỏc nhỏ giữa DNA đầu dũ và DNA đớch cũng cú thể tạo ra sự thay đổi vềđộ
năng liờn kết của DNA đầu dũ lờn bề mặt vi cảm biến và khả năng bắt cặp với DNA
đớch khiến thời gian đỏp ứng trở nờn nhanh hơn.
Hỡnh 3.3. Hỡnh ảnh HVĐTQ của màng polyme dẫn APTS trờn bề mặt vi cảm biến
3.3 Phổ hồng ngoại FTIR
Sau khi cốđịnh DNA đầu dũ đặc hiệu với HSV trờn bề mặt vi cảm biến thụng qua lớp màng APTS. Mỏy phõn tớch phổ hồng ngoại Thermo Nicolet 6700 FTIR được sử dụng để xỏc định cỏc liờn kết hoỏ học giữa cỏc phõn tử DNA đầu dũ với lớp APTS cũng như giữa APTS với bề mặt của vi cảm biến trờn dải số súng từ 4000 – 600cm-1 (hỡnh 3.4), kết quả được tham khảo và so sỏnh với nguồn chuẩn trong thư viện của mỏy phõn tớch FTIR. Trong đú, phổ hấp thụ tại cỏc đỉnh 1080, 791 và 1100 cm-1 tương
ứng với cỏc liờn kết của Si-O, Si-C và C-N của lớp màng polyme dẫn APTS trờn bề
mặt vi cảm biến, đỉnh 3380cm-1 thể hiện liờn kết giữa N-H. Trong khi đú, dải phổ dao
động trong khoảng 1800 – 1000cm-1 thể hiện cỏc liờn kết của phõn tử bazơ, đường và nhúm phosphat của phõn tử DNA đầu dũ. Cỏc đỉnh dao động trong khoảng 1128 cm-1- 1263 cm-1 tương ứng với tương tỏc giữa gốc phốt phat (-PO4) của DNA với màng polyme dẫn. Như vậy, với việc phõn tớch phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier đó xỏc
định sự tồn tại cỏc liờn kết húa học giữa lớp màng APTS với bề mặt vi cảm biến và liờn kết húa học giữa nhúm phốt phỏt của DNA đầu dũ với nhúm amino của APTS.
Nicolet 6700 FT-IR Spectrometer
Number of background scans:128 Number of sample scans: 128 Resolution: 2 cm-1 Title M1 61 9 6 64 9. 6 66 8. 8