Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp điều tra theo tuyến và ô tiêu chuẩn (OTC)
- Phương pháp ô tiêu chuẩn và tuyến điều tra được sử dụng trong đề tài theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [33] và Hoàng Chung (2008) [12]. Tuyến điều tra: căn cứ vào địa hình cụ thể của khu vực nghiên cứu lập các tuyến điều tra. Tuyến điều tra có hướng vuông góc hoặc song song với đường đồng mức, khoảng cách giữa các tuyến
điều tra là 50-100 m tùy vào loại hình cụ thể của từng quần xã. Dọc tuyến điều tra bố trí các ô tiêu chuẩn (OTC) và các ô dạng bản để thu thập số liệu.
- Ô tiêu chuẩn (OTC): áp dụng ô tiêu chuẩn có diện tích 100m2 (10m x 10m) cho các trạng thái rừng, 16m2 (4m x 4m) đối với thảm cây bụi, 1m2 (1m x 1m) đối với thảm cỏ. Trong OTC lập các ODB có diện tích 4m2 (2m x 2m) hoặc 25m2 (5m x 5m). Mỗi OTC lập 5 ODB (4 ODB ở 4 góc và 1 ODB ở trung tâm của OTC) thu thập số liệu về thành phần của thực vật. Trong các OTC và ODB tiến hành xác định tên khoa học của các loài cây thu thập được.
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí OTC và ODB ở trạng thái thảm thực vật
2.4.2. Phương pháp thu mẫu thực vật
-Đối với tuyến điều tra, tiến hành ghi chép các thông tin về từng loài cây bắt gặp trên tuyến như: tên Việt Nam (hoặc tên Latinh), dạng sống (cây thân gỗ, thân bụi, thân thảo, thân leo). Những loài cây chưa xác định được tên thì thu thập mẫu về phân loại sau.
-Đối với ô tiêu chuẩn, tiến hành thu thập mẫu trong các ô nhỏ (ô dạng bản), cách thu mẫu cũng giống như ở tuyến điều tra.
2.4.3. Phương pháp phân tích mẫu vật
- Xác định tên các loài cây theo Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (2003) [22], Cây gỗ rừng Việt Nam, Danh lục các loài thực vật Việt Nam (Nguyễn Tiến Bân và cộng sự) [2], Thực vật chí Việt Nam để chỉnh lý và lập danh lục các loài thực vật nói chung tại vùng nghiên cứu.
- Xác định các loài thực vật làm thuốc theo Cây thuốc Việt Nam (Lê Trần Đức, 1995) [21], Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (Đỗ Tất Lợi, 2004) [27], Từ điển
10 m
10 m 2 m
cây thuốc Việt Nam (Võ Văn Chi, 2003) [10], Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (Viện dược liệu, 2004), Danh lục các loài thực vật Việt Nam (Nguyễn Tiến Bân và cộng sự, 2002) [2], Cây thuốc Lào phần 1 (Bộ Y Tế Lào, 2014) [41], Cây thuốc dân tộc Mông (Bộ Y Tế Lào , 2014) [42].
- Xác định thành phần dạng sống theo Hoàng Chung (2008) [12].
- Xác định các loài thực vật làm thuốc quý hiếm tại khu vực nghiên cứu theo “Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật)” năm 2007 [3]; danh lục đỏ các loài cây thuốc Việt Nam của Viện dược liệu, 2004 [40].
2.4.4. Phương pháp điều tra trong nhân dân
Điều tra tình hình sử dụng cây thuốc và một số bài thuốc theo phương pháp nghiên cứu thực vật dân tộc học của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [33].
2.4.5. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
Theo Nguyễn Thượng Dong (2006)
Bước 1: chuẩn bị nguyên liệu: toàn cây của Thanh ngâm (Picria felterrae Lour.,) thuộc họ Hoa mõm sói sau khi thu hái được rửa sạch, để ráo nước sau đó đem đi sấy khô ở 500C đến khối lượng không đổi.
Nguyên liệu sau khi sấy khô và cắt nhỏ cho cây vào trong máy xay đa năng loại nhỏ thành bột dạng mịn. Bột để trong túi bóng kính, bảo quản nơi khô ráo để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
Bước 2: tạo cao chiết
Nguyên liệu dạng bột khô được đem đi pha dung môi cồn ở tỷ lệ 20 g/100ml, sau đó cho vào máy lắc với tần số 200 vòng/phút (để các chất có hoạt tính sinh học tan đều trong dung môi) ở các điều kiện thời gian khác nhau (24 giờ, 48 giờ và 72 giờ), sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc, 80 ml dịch lọc được đem đi cô đặc bằng máy sấy khô ở nhiệt độ 40 oC - 60 oC, đến khi có khối lượng khô không đổi và được bảo quản ở 40C để sử dụng trong các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn.
Bước 3: chuẩn bị giống vi khuẩn
Thử hoạt tính sinh học với 4 chủng vi sinh vật nhận từ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học - Vi sinh, khoa Sinh Học, trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên.
1. Serratia marcescens (Gram âm) 2. Staphylococcus aureus (Gram dương)
3. Bacillus subtilis (Gram dương)
4. Escherichia coli (Gram âm)
Môi trường LB được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật kiểm định: (Bảng 2. 1)
Bảng 2.1: Thành phần môi trường LB trong 1 lít nước cất
Hóa chất Khối lượng (g/l) Cao nấm men 5.0
NaCl 5.0
Peptone 5.0
Agar 20.0
Bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng: vi sinh vật được nuôi hoạt hóa trong môi trường LB, sau đó được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24 giờ ở 370C, giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyển giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ 2 tuần một lần. Sau đó, vi khuẩn được nuôi hoạt hóa môi trường LB lỏng, nuôi trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC để thử hoạt tính kháng khuẩn.
Bước 4: thử khả năng kháng khuẩn
Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của các loại dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Pha cao chiết: Hòa tan cao chiết được lắc trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ với dung môi DMS (Dimethyl Sulfoxide) thành các nồng độ theo yêu cầu bảng 2.2.
Bảng 2.2: Nồng độ hòa tan cao chiết với DMS
Lắc trong 24 giờ Lắc trong 48 giờ Lắc trong 72 giờ
Mẫu Nồng độ (g/l) Mẫu Nồng độ (g/l) Mẫu Nồng độ (g/l)
M1 10 M5 10 M9 10
M2 50 M6 50 M10 50
M3 100 M7 100 M11 100
M4 150 M8 150 M12 150
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Hóa lỏng môi trường LB đặc trong lò vi sóng, đổ đều môi trường vào các đĩa Petri, sau đó để nguội để môi trường đông đặc lại tạo thành mặt phẳng. Dùng micropipet hút 50μl dịch vi khuẩn vào giữa đĩa thạch chứa môi trường LB, dùng que cấy tam giác chang đều cho đến khi mặt thạch
khô. Đục 4 giếng trên môi trường thạch với đường kính 7 mm, mỗi giếng cách nhau 2 - 3 cm. Mỗi giếng thạch nhỏ 100μl các dịch chiết. Sử dụng đối chứng là dung môi DMS và nước cất (đã khử trùng). Để các đĩa thạch trong tủ lạnh 4oC trong 1- 2 giờ để dịch chiết khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm 28 - 300C, sau 24 giờ mang ra đo kích thước vòng vô khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo kích thước vòng vô khuẩn (ΔD) bằng công thức [18].
ΔD = D - d; trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính giếng thạch. ΔD ≥ 25mm: hoạt tính rất mạnh
ΔD ≥ 20mm: hoạt tính mạnh ΔD ≥ 10mm: hoạt tính trung bình ΔD < 10mm: hoạt tính yếu
Chương 3
ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN - KINH TẾ XÃ HỘI KHU VỰC NGHIÊN CỨU