- Điều khiển và cơ chế tạo kiểu mô. - Điều khiển quá trình tạo cơ quan, phôi.
6.7. Thực hành nuôi cấy Protoplast
6.7.1. Nguyên liệu thực vật
Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liệu tách protoplast. Sử
dụng các lá được tách trong ngày.
6.7.2. Chuẩn bị môi trường
Dung dịch enzyme tách protoplast:
+ Onozuka cellulase R10 0,5 % + Onozuka macerozyme R10 0,1 % + Onozuka macerozyme R10 0,1 %
+ Mannitol 13,0 %
+ pHmôi trường ~ 5,8
Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 µm. kính lỗ lọc 0,2-0,25 µm.
6.7.3. Tiến hành
* Ngày thứ nhất
àCác mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá. vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá.
àCho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml dung dịch enzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt dung dịch enzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút).
* Ngày thứ hai
àDùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng (Φ = 65µm) đặt trong cốc loại 50 ml. trong cốc loại 50 ml.
à Bổ sung thêm 3 ml dung dịch rửa (PI + 10% mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của bước trên.
à Bổ sung thêm 2 ml dung dịch rửa để rửa proptoplast hết khỏi lưới lọc l. Chuyển hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 ml) vào tube ly tâm loại 15 ml và ly tâm 50×g hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 ml) vào tube ly tâm loại 15 ml và ly tâm 50×g
trong 10 phút.
à Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và
232
protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ
từ dung dịch rửa bên thành tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g
trong 10 phút. Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch .
à Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên.
à Rửa protoplast thêm một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa. Loại bỏ phần nổi trên mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy trên mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy protoplast (PC).
à Đặt một giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ
protoplast (số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000). Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng. 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng.
à Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28oC. * Ngày thứ ba * Ngày thứ ba
Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 µmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vải thưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 thưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 ngày.
* Ngày thứ năm
Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 µmol/sec/m2) trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra. ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra.
* Ngày thứ bảy
Ghi lại kết quả của bài học nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia từ tổng số tế
bào nuôi cấy ban đầu, trong một mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự