3.3.3.1. Quá trình thuỷ phân do protease
Việc biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào E. coli nhiều khi không hiệu quả do các protein này bị thuỷ phân bởi protease có trong tế bào chủ. Có nhiều bằng chứng cho thấy quá trình thuỷ phân này phụ thuộc vào năng lượng. Vì vậy, các thể đột biến ảnh hưởng tới protease phụ thuộc năng lượng sẽ đảm bảo ổn định của protein ngoại lai. Bên cạnh đó việc định hướng protein tiết ra ngoài khoang chu chất hoặc ra môi trường nuôi cấy tế bào ở nhiệt độ thấp, cho gene ngoại lai biểu hiện cùng với sự biểu hiện của phân tử "bảo mẫu ("chaperone"). Trong tế bào các protease này có chức năng quan trọng là thuỷ phân các protein bất thường và proteinkhông hoàn thiện.
3.3.3.2. Quá trình tiết protein
Một trong những vấn đề hay gặp khi biểu hiện protein ở nội bào của tế bào E. coli là chúng thường tạo thành thể vùi (inclusion bodies). Mặc dù biểu hiện protein dưới dạng thể vùi cũng có một số ưu điểm nhất định nhưng protein tạo ra thường bị mất hoạt tính sinh học và quá trình tái tạo lại cấu trúc (refolding) tương đối phức tạp và tốn kém. Hầu hết protein được biểu hiện trong
E. coli đều được thiết kế để sau khi biểu hiện chúng được chuyển ra khoang chu
chất (perplasmic space) của tế bào. Một yếu tố không thể thiếu để protein có thể được chuyển qua màng trong ra ngoài khoang chu chất là đoạn peptit tín hiệu.
Protein sau khi được tổng hợp muốn trở thành protein có hoạt tính sinh học thì chúng phải có cấu trúc không gian đúng. Quá trình hình thành cấu trúc không gian phụ thuộc rất nhiều vào môi trường tbn trong và bên ngoài tế bào. Nếu môi trường có chất gây biến tính mạnh như urê, guanidin - HCl và các tác nhân khử thì quá trình hình thành cấu trúc không gian không thể diễn ra thuận lợi.
Sự tạo thành cầu disulfit trong quá trình cuộn xoắn của protein có thể diễn ra bởi oxi hoá trong không khí có sự xúc tác của ion kim loại hoặc phức hợp oxi hoá khử của S.
Một ví dụ về sự biểu hiện gene mã hoá cho RIP ở E. coli. RIP được biểu hiện bằng hệ vector pMAL - C2. Vector biểu hiện protein bất hoạt ribosome tipe I được thiết kế dựa trên cơ sở casette vector pMAL - C2 (RIKEN DNA Bank Japan). Để tiến hành, cặp primer có chứa các điểm cắt của EcoRI và HindIII đã được tổng hợp và sử dụng để nhân đoạn gene mã hoá cho toàn bộ phân tử RIP thành thục (bao gồm 247 amino axit, bắt đầu từ Asp24 và kết thúc bằng Ala27). Đoạn gene nhân được bằng PCR sau xử lí với EcoRI và HindIII được gắn vào vùng cắt gắn đa vị (MCS) của vector pMAL - C2 ở đúng các vị trí cắt của các enzyme kể trên.
THẢO LUẬN