STT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)
1 100 1 100% 98 – 102 2 ≥ 10 10-1 10% 98 – 102 3 ≥ 1 10-2 1% 97 – 103 4 0,1 10-3 0,1% 95 – 105 5 0,01 10-4 100 mg/L 90 – 107 6 0,001 10-5 10 mg/L 80 – 110 7 0,0001 10-6 1 mg/L 80 – 110 8 0,00001 10-7 100 ppb 80 – 110 9 0,000001 10-8 10 ppb 60 – 115 10 0,0000001 10-9 1 ppb 40 – 120
29 2.3.3.2. Quy định về độ lặp lại STT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) 1 100 1 100% 1,3 2 10 10-1 10% 1,8 3 1 10-2 1% 2,7 4 0,1 10-3 0,1% 3,7 5 0,01 10-4 100 mg/L 5,3 6 0,001 10-5 10 mg/L 7,3 7 0,0001 10-6 1 mg/L 11 8 0,00001 10-7 100 ppb 15 9 0,000001 10-8 10 ppb 21 10 0,0000001 10-9 1 ppb 30 2.3.3.3. Quy định về điểm nhận dạng IP
Kỹ thuật Số ion Số điểm IP
GCMS (EI hoặc CI) N N
GCMS (EI và CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4
GCMS (EI hoặc CI) 2 (dc A) + 2 (dc B) 4
LCMS N N
GC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
30
GC-MS-MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5 LC-MS –MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5 LC-MS-MS-MS 1 ion mẹ, 1 ion con và 2 ion cháu 5,5
HRMS N 2n
GC-MS và LC-MS 2 + 2 4
GC-MS và HRMS 2 + 1 4
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU
2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích tối ưu của cathinone tổng hợp
2.4.1.1. Điều kiện phân tích trên thiết bị sắc ký khí (GC/MS) a. Lựa chọn điều kiện trên thiết bị GC-MS a. Lựa chọn điều kiện trên thiết bị GC-MS
- Hệ thống sắc ký khí khối phổ kép Agilent 7890A GC System và 7000 GC/MS Triple Quad với cột sắc ký là TraceTM TR-35MS (30m x 250µm; 0,25µm), tỷ lệ chia dòng 19:1, nhiệt độ inlet: 225°C, khí mang: Heli.
- Điều kiện MS: Chế độ quét: Quét toàn phổ (full scan) trong khoảng 50 – 550 m/z, thế ion hóa: 70 eV, nhiệt độ lò sang cột transferline: 300°C, nhiệt độ nguồn ion: 230°C, nhiệt độ buồng tứ cực: 150°C.
b. Khảo sát tốc độ dòng pha động
Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến quá trình tách sắc ký gồm: 0,8 mL/phút, 1,0 mL/phút và 1,2 mL/phút.
c. Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Khảo sát các thể tích 0,5 µL, 1,0 µL và 1,5 µL.
c. Khảo sát chương trình nhiệt độ của lò
Tiến hành nghiên cứu các chương trình sắc ký (gọi tắt là CTSK) sau: + CTSK 1: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 5°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
31
+ CTSK 2: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 8°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
+ CTSK 3: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 12°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
2.4.1.2. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết
- Đối với phương pháp chiết lỏng-lỏng, dung môi chiết đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết các chất phân tích ra khỏi hỗn hợp. Tuy nhiên, dung môi được lựa chọn cũng cần thỏa mãn các tiêu chí:
+ Dung môi không hòa tan trong nước.
+ Dung môi ít độc, dễ kiếm (tương đối thông dụng, thường dùng trong các phòng thí nghiệm phân tích).
+ Nhiệt độ sôi thấp (để dễ bay hơi khi đuổi dung môi khỏi dịch chiết). + Dễ phân tách pha khi chiết xuất.
+ Ngoài ra có thể xem xét thêm các yếu tố như an toàn cháy nổ và khả năng gây kích ứng khi người phân tích tiếp xúc.
Với các tiêu chí trên, chúng tiến hành khảo sát các dung môi chiết thông dụng trong phòng thí nghiệm như: ethyl acetate, diethyl ether, chloroform và n-hexane.
Tiến hành:
- Mẫu trắng thêm chuẩn: Lấy 5 mL dịch lọc mẫu trắng, thêm 0,5 mL hỗn hợp chuẩn ở nồng độ 200 mg/L, điều chỉnh đến pH=11 bằng dung dịch NaOH 1M. Thêm 5 mL dung môi chiết lắc xoáy 3 – 5 phút, ly tâm 5 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để tách pha. Dịch chiết thu được cho chảy qua Na2SO4 khan, lấy 1 mL pha hữu cơ, thêm 100 µL hỗn hợp Methanol + HCl 1%. Thổi khô dung môi bằng dòng khí nitơ tới cắn. Thêm 1 mL dung dịch nội chuẩn docosane 50 mg/L. Mỗi dung môi làm lặp lại ba lần.
32
- Mẫu chuẩn: Lấy 1 mL hỗn hợp dung dịch chuẩn nồng độ 200 mg/L, thêm 0,5 mL dung dịch nội chuẩn docosane 1000 mg/L, định mức thành 10 mL bằng methanol.
2.4.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường chiết (pH)
Sau khi lựa chọn được dung môi tốt nhất cho việc chiết mẫu, sử dụng dung môi đó để khảo sát pH môi trường. Do các cathinone tổng hợp thường ở dạng hydrochloride nên thường được chiết với bazơ để có thể thu được hình dạng pic tốt hơn trong quá trình phân tích GC-MS. Trong nghiên cứu này, khoảng pH = 8 – 12 được lựa chọn khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đối với quá trình chiết. Các giá trị pH trong khoảng này được điều chỉnh bằng cách sử dụng đệm phosphate.
Tiến hành:
- Mẫu trắng thêm chuẩn: Lấy 5 mL dịch lọc mẫu trắng, thêm 0,5 mL hỗn hợp chuẩn ở nồng độ 200 mg/L, điều chỉnh pH đến các giá trị pH=8; pH=9; pH=10; pH=11; pH=12 bằng các dung dịch đệm phosphate. Thêm 5 mL dung môi chiết đã tối ưu được, lắc xoáy 3 – 5 phút, ly tâm 5 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để tách pha. Dịch chiết thu được cho chảy qua Na2SO4 khan, lấy 1 mL pha hữu cơ, thêm 100 µL hỗn hợp Methanol + HCl 1%. Thổi khô dung môi bằng dòng khí nitơ tới cắn. Thêm 1 mL dung dịch nội chuẩn docosane 50 mg/L. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong Chương 3.
- Mẫu chuẩn: Lấy 1 mL hỗn hợp dung dịch chuẩn nồng độ 200 mg/L, thêm 0,5 mL dung dịch nội chuẩn docosane 1000 mg/L, định mức thành 10 mL bằng methanol.
2.5. CÁCH TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.5.1. Tính đặc hiệu, tính chọn lọc
- Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện các chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự,... Trong phép phân tích định tính phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có
33
mặt chất phân tích và âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích.
- Tính chọn lọc là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc.
- Để xác định được tính đặc hiệu, tính chọn lọc chúng tôi sử dụng phương pháp xác nhận. Cần xác định được thời gian lưu của chất phân tích sao cho:
+ Mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích. + Mẫu thêm chuẩn phải cho tín hiệu tại thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất chuẩn.
Ngoài ra cần đáp ứng yêu cầu về số điểm nhận dạng IP. Theo quy định của Hội đồng châu Âu (EC) thì số điểm IP đối với phương pháp GC-MS là 4 [27].
2.5.2. Xây dựng đường chuẩn
Trong phân tích định lượng khi tăng nồng độ chất phân tích đến giá trị nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn phụ thuộc tuyến tính. Tại nồng độ lớn nhất của chất phân tích mà tín hiệu phân tích còn tuân theo phương trình tuyến tính bậc nhất thì gọi là giới hạn tuyến tính. Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tính gọi là khoảng tuyến tính.
Sau khi xác định được khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ chất phân tích vào đại lượng đo (chiều cao píc hoặc diện tích píc) trong khoảng tuyến tính.
Phương trình đường chuẩn dạng y = (a ± t.Sa) + (b ± t.Sb).x Trong đó: b: hệ số góc của đường chuẩn
a: hệ số tự do.
Khoảng tin cậy của b và a được tính là: b ± t. Sb và a ± t. Sa Sa, Sb: sai số của hệ số a và b.
34 Hệ số tương quan: 0,99 ≤ R2 ≤ 1,00.
Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị vào các bình định mức 10 mL hỗn hợp các dung dịch chuẩn của cathinone tổng hợp sao cho nồng độ mỗi cathinone tổng hợp thay đổi từ 10 mg/L, 20 mg/L, 50 mg/L, 70 mg/L và 100 mg/L. Thêm 0,5 mL dung dịch nội chuẩn docosane 1000 mg/L, định mức thành 10 mL bằng methanol. Phân tích ở điều kiện tối ưu ở mục 3.1. Làm lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ, tính trung bình, kết quả được trình bày ở chương 3.
2.5.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của thiết bị
Giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và giới hạn định lượng của thiết bị (IQL) được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N = Signal to noise ratio).
IDL: là nồng độ mà tại đó tín hiệu chất phân tích lớn gấp 3 lần tín hiệu nhiễu đường nền (tức là tỷ lệ S/N » 3).
IQL: là nồng độ mà tại đó tín hiệu chất phân tích lớn gấp 10 lần tín hiệu nhiễu đường nền (tức là tỷ lệ S/N » 10).
Xác định IDD và IQL bằng cách phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ thấp nhỏ dần đến khi còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ S/N dựa vào phần mềm của thiết bị.
2.5.4. Tính phù hợp của phương pháp
Với mỗi cathinone tổng hợp, tiến hành phân tích lặp lại 6 lần hỗn hợp chuẩn cathinone ở nồng độ thấp (5 mg/L) và đánh giá độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu và tỷ lệ diện tích píc sắc ký (RSD hoặc CV) theo công thức:
!"#% = &'% ="#
+, × 100
SD: Độ lệch chuẩn của kết quả phân tích ở các thí nghiệm độc lập
X
.: Giá trị trung bình của các kết quả phân tích Kết quả được trình bày ở chương 3.
35
2.5.5. Độ chụm (độ lặp lại)
Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên hay độ chụm chỉ mức độ dao động (mức độ lặp lại) của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình.
Tiến hành các thí nghiệm độc lập đối với mẫu chuẩn của các cathinone ở ba khoảng nồng độ khác nhau (nồng độ thấp, nồng độ trung bình và nồng độ cao) và đánh giá độ chính xác thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo nồng độ chất phân tích. Kết quả được trình bày ở chương 3.
2.5.6. Hiệu suất thu hồi (độ thu hồi)
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Giống với độ chụm, độ đúng cũng là khái niệm định tính. Độ đúng thường được diễn tả bằng độ chệch hay độ thu hồi.
Tiến hành phân tích lặp lại đối với mẫu trắng thêm chuẩn hoặc mẫu thử thêm chuẩn ở ba mức nồng độ khác nhau (nồng độ thấp, nồng độ trung bình, nồng độ cao) trong khoảng nồng độ của đường chuẩn.
+ Với mẫu trắng thêm chuẩn, độ thu hồi được tính theo công thức:
!% = &%% &&
× 100
Trong đó: Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Cc: Nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu trắng (lý thuyết). + Với mẫu thử thêm chuẩn, độ thu hồi được tính theo công thức
R% = C'() − &*
C)
× 100
Trong đó: Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cc: Nồng độ chất chuẩn thêm vào (lý thuyết)
36
2.6. ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT MA TUÝ NHÓM CATHINONE TỔNG HỢP TRONG MẪU VIÊN NÉN CATHINONE TỔNG HỢP TRONG MẪU VIÊN NÉN
Sau khi khảo sát và tối ưu được quy trình phân tích, áp dụng phân tích 04 chất ma tuý tổng hợp nhóm cathinone gồm: Mephedrone, Alpha-PVP, N- ethylpentylone và MDPV trên các mẫu thực thu được từ các vụ án, chuyên án. Mẫu thực tế là mẫu viên nén thu trong 04 vụ án, chuyên án xuất hiện tại Việt Nam do Cơ quan điều tra cung cấp (Bảng 2.1). Kết quả phân tích mẫu thực sẽ được trình bày trong Chương 3.
+ Vụ án thứ 1: Quyết định trưng cầu giám định số 82/QĐ ngày 06 tháng 4 năm 2021 của Cơ quan Cảnh sát điều tra Công an thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Mẫu vật gồm các viên nén hình trụ tròn màu trắng đục, trên một mặt mỗi viên có in hình bông hoa, khối lượng trung bình viên: 358,0 mg/viên (ký hiệu mẫu M1).
+ Vụ án thứ 2: Quyết định trưng cầu giám định số 18/CSĐT ngày 22 tháng 01 năm 2021 của Cơ quan Cảnh sát điều tra Công an huyện Mường La, tỉnh Sơn La. Mẫu vật gồm các viên nén hình trụ tròn màu nâu, trên một mặt mỗi viên có in hình con gà trống, khối lượng trung bình viên: 306,2 mg/viên (ký hiệu mẫu M2).
+ Vụ án thứ 3: Quyết định trưng cầu giám định số 102 ngày 26 tháng 8 năm 2021 của Cơ quan Cảnh sát điều tra Công an thành phố Hải Dương, tỉnh Hải Dương. Mẫu vật gồm các viên nén hình trụ tròn màu xanh trắng, trên một mặt mỗi viên có in hình mũi tên, khối lượng trung bình viên: 440,5 mg/viên (ký hiệu mẫu M3).
+ Vụ án thứ 4: Quyết định trưng cầu giám định số 37/QĐ-CSĐT ngày 17 tháng 8 năm 2020 của Cơ quan Cảnh sát điều tra Công an huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Mẫu vật gồm các viên nén hình đầu chuột mickey màu trắng, khối lượng trung bình viên: 485,1 mg/viên (ký hiệu mẫu M4).
37
Bảng 2.1. Mẫu viên nén ma tuý tổng hợp nhóm cathinone
STT Logo, hình ảnh viên Ký hiệu mẫu
Khối lượng trung bình viên (mg/viên)
1 M1 358,0
2 M2 306,2
3 M3 440,5
38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH TỐI ƯU CỦA CATHINONE TỔNG HỢP CATHINONE TỔNG HỢP
3.1.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị sắc ký khí khối phổ (GS-MS) khối phổ (GS-MS)
3.1.1.1. Kết quả lựa chọn điều kiện trên thiết bị GC-MS
Qua tham khảo tài liệu và thực nghiệm phân tích giám định các chất ma túy và tiền chất ma túy tại trung tâm giám định ma túy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên thiết bị GC-MS với các thông số máy sau:
- Thiết bị: Hệ thống sắc ký khí khối phổ Agilent 7890A GC System và 7000 GC/MS Triple Quad
- Điều kiện GC:
+ Cột sắc ký: Cột TraceTM TR-35MS (30m x 250µm; 0,25µm) + Thể tích tiêm mẫu: 1 µL với tỷ lệ chia dòng 19:1
+ Nhiệt độ inlet: 225°C
+ Khí mang: Heli. Tốc độ dòng khí mang: 1,0 mL/phút
+ Chương trình gradient: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 8°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
- Điều kiện MS:
+ Chế độ quét: Quét toàn phổ trong khoảng 50 – 550 m/z + Thế ion hóa: 70 eV
+ Nhiệt độ transferline: 300°C.
+ Nhiệt độ nguồn ion: 230°C, nhiệt độ buồng tứ cực: 150°C
3.1.1.2. Kết quả khảo sát tốc độ dòng
Tốc độ dòng cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả tách sắc ký. Khi tốc độ nhỏ quá, chất phân tích ra muộn gây doãng píc, giảm độ nhạy. Khi tốc độ lớn quá có thể làm cho chất phân tích chưa tách ra khỏi nền
39
mẫu đã bị đẩy ra khỏi cột dẫn đến hiện tượng chồng lấn píc của chất phân tích với tạp chất.
Tốc độ dòng tối ưu được lựa chọn khi phân tích hỗn hợp chuẩn gồm Mephedrone, Alpha-PVP, N-ethylpentylone và MDPV ở nồng độ 50 mg/L, dung dịch nội chuẩn docosane 50 mg/L, giữ nguyên các thông số về GC và MS như trên, chỉ thay đổi tốc độ dòng: 0,8 mL/phút, 1,0 mL/phút, 1,2 mL/phút. Kết quả được trình bày lần lượt tương ứng ở Hình 3.1, Hình 3.2 và Hình 3.3: