2.3.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy do Sigma, Mỹ và Trung Quốc sản xuất dùng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 2.1. Thành phần và cách pha môi trường BG-11 nêu trên được tham khảo theo tác giả Đỗ Thị Cẩm Vân và cộng sự [74].
Bảng 2. 1. Các hoá chất thí nghiệm STT Tên hóa chất/công thức phân tử Độ tinh
khiết Xuất xứ
1 Sodium nitrate (NaNO3) 95% Sigma
2 Dipotassium phosphate (K2HPO4) 95% Sigma 3 Magnesium sulphate heptahydrate
(MgSO4•7H2O) 95% Sigma
4 Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) 95% Sigma
5 Citric acid (C₆H₈O₇) 95% Sigma
6 Ferric ammonium citrate
((NH4)5[Fe(C6H4O7)2]) 95% Sigma 7 EDTA (disodium magnesium salt) 95% Sigma 8 Sodium carbonate (Na2CO3) 95% Merck
9 Axit boric (H3BO3) 95% Trung Quốc
10 Manganese(II) chloride tetrahydrate
(MnCl2•4H2O) 95% Trung Quốc
11 Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4•7H2O) 95% Merck 12 Sodium molybdate dihydrate
(Na2MoO4•2H2O) 95% Merck
13 Copper sulfate pentahydrate
(CuSO4•5H2O) 95% Merck
14 Cobaltous nitrate hexahydrate (Co(NO
3)2•6H2O) 95% Merck
15 Agar 95% Merck
16 Sodium thiosulphate (Na2S2O3·5H2O) 95% Sigma- Aldrich, Mỹ
17 Cồn công nghiệp 96% Việt Nam
18 Sodium bicarbonate (NaHCO3) 95% Trung Quốc 19 Ferrous sulphate heptahydrate (FeSO
STT Tên hóa chất/công thức phân tử Độ tinh
khiết Xuất xứ
20 Sodium chloride (NaCl) 95% Việt Nam
21 Hexane 95% Trung Quốc
22 Sulfuric acid (H2SO4) 98% Trung Quốc
23 Methanol 98% Trung Quốc
24 Acetanilide ≥99,5% (CHN) Aldrich, Mỹ Sigma-
25 NaHCO3 ≥99.7% Sigma-
Aldrich, Mỹ 2.3.2. Thiết bị & dụng cụ
Hệ thống kín panel tấm phẳng được thiết kế, chế tạo và vận hành bởi Viện Hóa học. Thiết bị làm bằng vật liệu acrylic trong suốt (với độ dày 10 mm) dạng hình hộp chữ nhật, có kích thước dài × rộng × cao = 120 cm ×15 cm × 61 cm, tổng dung tích 100 L (thể tích làm việc 90 L). Thiết bị panel phẳng được trang bị một ống nhựa tiền phong ϕ21 nối với ống nano phân phối khí dạng chữ T. Ống phân phối khí được nối với téc CO2 qua ống silicon ϕ8 và các đầu lọc khí (PTTE 0,22 µm, 5 cm, Rocker Scientific Co., Ltd, Taipei, Đài Loan) (Hình 2.2).
Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu như máy đo cường độ ánh sáng (TM-204, Tenmars Electronics CO., Ltd, Taiwan), máy khuấy (AREX, Velp, Ý), máy thổi khí (MAC40R, Fujimac, Nhật), Téc CO2 (Loại 25 kg, Indochina Gas, Việt Nam), thiết bị điều chỉnh lưu lượng khí (DFG-6T, Darhor Technology Co., Limited, Hangzhou, Zhejiang, Trung Quốc), hệ thiết bị phân tích tổng cacbon và tổng nitơ (TOC/TN) (MultiN/C, Analytik Jena, Đức) của Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Viện Hóa học, máy phân tích thành phần nguyên tố (CHNSO Analyzer) (2400 CHNS/O Series II System, PerkinElmer, Mỹ) của trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis (U2900, Hitachi, Nhật Bản) của Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học. Ngoài ra có sử dụng một số dụng cụ như bình nuôi tảo, giấy lọc, đầu lọc khí, dây silicon… được sử dụng trong quá trình nuôi cấy và theo dõi sinh trưởng của tảo (Bảng 2.2).
Bảng 2. 2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.
STT Tên thiết bị/dụng cụ Model Xuất xứ Địa điểm đặt 1 Máy đo cường độ ánh sáng TM-204
Tenmars Electronics CO., Ltd, Taiwan Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
2 Bình thủy tinh tam
giác 250 mL Trung Quốc
Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
3 Chai thủy tinh 1 L Đức Phòng Hóa học xanh,
Viện Hóa học
4 Chai thủy tinh 5 L Đức Phòng Hóa học xanh,
Viện Hóa học
5 Giấy lọc 3 μm (4 cm) Whatman Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học 6 Đầu lọc khí 0,22 μm PTTE 0,22 µm × 5 cm Rocker Scientific Co., Ltd, Taipei, Đài Loan Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
7 Máy khuấy từ AREX Velp, Ý Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
8 Đền LED BD M16L 120/36W Rạng Đông, Việt Nam Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học 9 Ống dây silicon Việt Nam Phòng Hóa học xanh,
Viện Hóa học 10 Máy thổi khí MAC40R Fujimac,
Nhật Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học 11 Téc CO2 Loại 25 kg Indochina Gas, Việt Nam Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
STT Tên thiết bị/dụng cụ Model Xuất xứ Địa điểm đặt
12 Thiết bị điều chỉnh lưu
lượng khí DFG-6T Darhor Technology Co., Limited, Hangzhou, Zhejiang, Trung Quốc Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
13 Que cấy tảo Việt Nam Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
14 Băng dính Việt Nam Phòng Hóa học xanh,
Viện Hóa học
15 Parafin Mỹ Phòng Hóa học xanh,
Viện Hóa học
16 Máy đo pH HI2211-02 Hana, Mỹ Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
17 Đèn cồn Việt Nam Phòng Hóa học xanh, Viện Hóa học
18 Giấy bạc Việt Nam Phòng Hóa học xanh,
Viện Hóa học 19
Hệ thiết bị phân tích tổng cacbon và tổng nitơ (TOC/TN)
MultiN/C Analytik Jena, Đức
Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Viện Hóa học 20 Máy phân tích thành phần nguyên tố (CHNSO Analyzer) 2400 CHNS/O Series II System PerkinElmer, Mỹ
Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ
2.3.3. Phương pháp thực nghiệm 2.3.3.1. Nhân giống tảo 2.3.3.1. Nhân giống tảo
Tảo giống Chlorella sorokiniana TH02từ bình giống cấy sang bình tam giác 500 mL chứa 250 mL BG-11 (Bảng 2.3). Tảo giống liên tục được lắc đều 100 vòng/phút và ánh sáng chiếu liên tục chiếu sáng suốt 24 giờ trong 1 tuần để đạt tảo giống có nồng độ tế bào 2,5×106 tế bào/mL. Nhiệt độ sinh trưởng của tảo được điều chỉnh ở 25 oC, ánh sáng nhân tạo dùng đèn LED có cường độ 60 µmol/m2∙s(Hình 2.1A). Tảo được tiếp tục nuôi nâng cấp trong bình thủy tinh Simax 5 L chứa 4 L môi trường BG-11 và nuôi trong vòng 1 tuần để đạt nồng độ 4,2×107 tế bào/mL. Khí được sục vào thiết bị phản ứng quang sinh học qua đầu lọc khí (PTTE 0,22 µm, 5 cm, Rocker Scientific Co., Ltd, Taipei, Đài Loan) (bằng máy sục khí với tốc độ 400 mL/phút) điều chỉnh bằng thiết bị đo lưu lượng (DFG-6T, 0,1 – 0,8 L/min, Darhor Technology Co., Limited, Hangzhou, Zhejiang, Trung Quốc) để tạo dòng khí có hàm lượng CO2 0,04% (Hình 2.1B). Thiết bị phản ứng được chiếu sáng bằng hệ thống đèn LED, tạo ra cường độ ánh sáng 60 µmol/m2∙s, (chu kỳ 16 giờ/8 giờ). Mẫu tảo được lấy hàng ngày để đo diễn biến của nhiệt độ, pH, mật độ quang (OD), nồng độ sinh khối của mẫu tảo 1 lần/ngày.
Hình 2. 1. Nhân nuôi tảo Chlorella sorokiniana TH02giống. Trong bình tam giác 500 mL (A), trong chai trung tính 5 L (B).
Bảng 2. 3.Thành phần dinh dưỡng môi trường BG 11.
Thành phần Đơn vị (g/L) NaNO3 1,5 K2HPO4 0,04 MgSO4·7H2O 0,075 CaCl2·2H2O 0,036 Citric acid 0,006
Ferric ammonium citrate 0,006
Na2EDTA·2H2O 0,001
Na2CO3 0,02
Hỗn hợp vi lượng-kim loại (mix A5) 1 mL/L
Hỗn hợp Mix A5 bao gồm: H3BO3, 2,86 g/L; MnCl2·4H2O, 1,81 g/L;
ZnSO4·7H2O, 0,222 g/L; Na2MoO4·2 H2O, 0,39 g/L; CuSO4·5H2O, 0,079 g/L; Co(NO3)2·6H2O, 0,0494 g/L.
2.3.3.2. Nghiên cứu sinh trưởng và xử lý CO2 của Chlorella sorokiniana TH02 trong thiết bị panel phẳng
Sinh trưởng và hiệu quả cố định CO2 của Chlorella sorokiniana TH02 dưới nồng độ CO2 khác nhau
Thiết bị phản ứng tấm panel phẳng được chiếu sáng với hệ đèn bóng đèn LED công suất cao mua từ Công ty Phíc nước Rạng Đông (Thanh Xuân, Hà Nội) tạo ra cường độ ánh sáng 60 µmol/m2∙s (16 giờ/8 giờ). Nhiệt độ trong phòng thí nghiệm duy trì từ 25-27 oC. Nồng độ CO2 được hiệu chỉnh theo lưu lượng kế và được liệt kê trong Bảng 2.4 sau. Mẫu được lấy trong hàng ngày 100 mL và thực hiện các phép đo mật độ quang, pH và tính các thông số tăng trưởng của vi tảo và hiệu suất xử lý CO2. Mẫu tảo được lọc và sấy tảo thành sinh khối khô để phân tích thành phần cacbon trong sinh khối tảo phục vụ tính toán hiệu quả xử lý CO2.
Téc CO2 Van Van Bơm không khí Lưu lượng kế Lưu lượng kế Lưu lượng kế Bóng đèn LED Bóng đèn LED Đầu lọc khí
Ống naotube phân phối khí (A)
Hình 2. 2. Mô hình thiết bị phản ứng panel phẳng (A) và mô hình thiết bị thực (B).
Bảng 2. 4. Nồng độ CO2 khác nhau điều chỉnh bởi lưu lượng CO2 và lưu lượng không khí thông qua lưu lượng kế.
Nồng độ CO2 (%) Lưu lượng CO2 công nghiệp (L/phút)a Lưu lượng không khí (L/phút)b Lương hỗn hợp CO2 + không khí (L/phút)c 0,04 0 10 1 5 0,5 9,5 1 10 1,0 9,0 1 15 1,5 8,5 1 20 2,0 8,0 1
aLưu lượng CO2 công nghiệp (99,99%) điều chỉnh bởi lưu lượng kế (DFG- 6T, 0,1 – 5 L/phút, Darhor Technology Co., Limited, Hangzhou, Zhejiang, Trung Quốc)
bKhông khí bơm bởi máy thổi khí được điều chỉnh bởi lưu lượng kế (DFG- 6T, 2 – 20 L/phút, Darhor Technology Co., Limited, Hangzhou, Zhejiang, Trung Quốc)
cLưu lượng hỗn hợp CO2+không khí được điều chỉnh bởi lưu lượng (DFG- 6T, 0,1 – 5 L/phút, Darhor Technology Co., Limited, Hangzhou, Zhejiang, Trung Quốc)
Sinh trưởng và hiệu quả cố định CO2 của Chlorella sorokiniana TH02 dưới cường độ ánh sáng khác nhau
Cường độ ánh sáng nghiên cứu là các giá trị 60, 100, 150, 200, 250, 300 và 400 µmol/m2/s theo chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/8 giờ. Các cường độ ánh sáng khác nhau được tạo bởi bóng đèn LED có công suất phù hợp. CO2 được điều chỉnh theo nồng độ tối ưu cho sự tăng trưởng của sinh khối tảo Chlorella sorokiniana TH02 đạt được ở bước nghiên cứu trên. Nhiệt độ thí nghiệm được duy trì ở 25 – 27 oC. Mẫu được lấy trong hàng ngày 100 mL và thực hiện các phép đo mật độ quang, pH và tính các thông số tăng trưởng của vi tảo và hiệu suất hấp thụ CO2. Mẫu tảo được lọc và sấy khô để xác định sinh khối khô để phân tích thành phần cacbon trong sinh khối tảo phục vụ tính toán hiệu quả hấp thụ CO2.
Sinh trưởng và hiệu quả cố định CO2 của Chlorella sorokiniana TH02 dưới tốc độ sục khí khác nhau
Tốc độ sục khí nghiên cứu là các giá trị 0,5, 1, 2, 3 và 4 L/phút. Cường độ ánh sáng và nồng độ CO2 được kiểm soát tương ứng tại 100 – 150 µmol/m2∙s và 5%. Mẫu được lấy trong hàng ngày 100 mL và thực hiện các phép đo mật độ quang, pH và tính các thông số tăng trưởng của vi tảo và hiệu suất xử lý CO2. Mẫu tảo được lọc và sấy tảo thành sinh khối khô để phân tích thành phần cacbon trong sinh khối tảo phục vụ tính toán hiệu quả xử lý CO2.
Sinh trưởng, năng suất sinh khối và tốc độ xử lý cacbon của chủng Chlorella sorokiniana TH02 dưới điều kiện nuôi ngoài trời
Trong phần thí nghiệm này, hệ phản ứng được thử nghiệm để kiểm tra khả năng sinh trưởng và xử lý CO2 của Chlorella sorokiniana TH02dưới điều kiện nhiệt độ và ánh sáng thay đổi tự nhiên (Hình 1.3). Thí nghiệm được tiến hành trong tháng 8/2020. Ánh sáng được đo hàng ngày bằng máy đo cường độ ánh sáng (TM-204, Tenmars Electronics CO., Ltd, Đài Loan) để quan sát sự
thay đổi của cường độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo. Nồng độ CO2 thí nghiệm và tốc độ sục khí được kiểm soát là 5% và 1 L/phút. Mẫu được lấy trong hàng ngày 100 mL và thực hiện các phép đo mật độ quang, pH và tính các thông số tăng trưởng của vi tảo và hiệu suất xử lý CO2. Mẫu tảo được lọc và sấy tảo thành sinh khối khô để phân tích thành phần cacbon trong sinh khối tảo phục vụ tính toán hiệu quả xử lý CO2.
Thu hoạch tảo
Tảo được thu hoạch bằng phương pháp ly tâm và sấy khô bằng phương pháp sấy lạnh (MSL300MT, Mactech Co., Ltd, Vietnam) để thu sinh khối khô. Sinh khối khô được nghiền thủ công bằng máy nghiền bột gia đình (800A, LaLiFa Co., Ltd, Vietnam) để thu tảo bột có kích thước 5-10 µm.
2.3.4. Phương pháp phân tích 2.3.4.1. Đo pH và nhiệt độ 2.3.4.1. Đo pH và nhiệt độ
Khi sục CO2 vào nước sẽ tạo thành axit cacbonic (H2CO3) làm thay đổi nồng độ môi trường và ảnh hưởng đến sự phát triển sinh khối tảo. Việc đo pH cũng được tiến hành 1 lần/ngày trong suốt chu kỳ nuôi cấy tảo để quan sát sự biến đổi pH trong môi trường nuôi cấy tảo. Song song với việc đo pH thì đo nhiệt độ cũng được tiến hành lần/ngày với môi trường trong suốt chu kỳ nuôi cấy tảo.
2.3.4.2. Xác định sinh khối khô
Sinh trưởng của tảo được xác định hàng ngày bằng cách đo mật độ quang tại bước sóng 750 nm (OD750) dùng máy UV/VIS (U2900, Hitachi, Nhật Bản) hoặc xác định sinh khối khô. Mật độ quang có thể được chuyển đổi thành sinh khối khô của tảo thông qua quan hệ tuyến tính giữa khối lượng tảo khô với mật độ quang. Sinh khối khô của tảo (X, g/L) ban đầu được xác định bằng cách tính khối lượng khô của tảo trong một thể tích tảo nước nhất định (10 mL) sau khi lọc và sấy khô ở trong lò 105 oC trong vòng 24 giờ.
Công thức tính sinh khối khô tảo thu được: 1 0 M -M X= V (1) Trong đó: X: Nồng độ tảo (g/L)
M0: Khối lượng giấy lọc ban đầu (g), sấy ở 105 oC trong 48 giờ. M1: Khối lượng giấy lọc sau khi lọc tảo (g), sấy ở 105 oC trong 48 giờ.
V: Thể tích tảo lọc (mL).
2.3.4.3. Tính toán tốc độ sinh trưởng đặc trưng của tảo Tốc độ sinh trưởng của tảo được tính theo công thức sau:
n 0 n 0 X ln X μ = t -t (ngày–1) (2) Trong đó, Xn và X0 (g/L) là nồng độ tảo đo được tại các thời điểm tương ứng là tn và t0 (tính theo ngày); µ là tốc độ sinh trưởng đặc trưng của tảo (1/ngày).
2.3.4.4. Tính toán năng suất sinh khối tảo
Tổng năng suất sinh khối tảo (Ptổng, mg/L∙ngày) được tính theo phương trình sau:
Ptổng = ΔX/Δt (3) Trong đó, ΔX là sự thay đổi nồng độ sinh khối tảo (mg/L) trong khoảng thời gian Δt (ngày).
2.3.4.5. Phân tích thành phần carbon trong sinh khối tảo và nồng độ carbon vô cơ hòa tan trong môi trường nuôi
Dạng cacbon vô cơ hòa tan (dissolved inorganic carbon, DIC) bao gồm HCO3-, CO32-, CO2 và H2CO3. Tuy nhiên, DIC tồn tại chủ yếu là HCO3- (chiếm hơn 90%) [75] vì H2CO3 là một axit yếu không bền bị phân hủy ngay thành CO2 và H2O. Vì vậy, nồng độ DIC có thể được tính theo HCO3-. Nồng độ cacbon vô cơ hòa tan (DIC) trong môi trường nuôi của vi tảo Chlorella
sorokiniana TH02 được phân tích bằng hệ thiết bị phân tích tổng cacbon và tổng nitơ (TOC/TN) (Multi N/C3100 , Analytik Jena, Đức) với chất chuẩn là NaHCO3 được pha trong dải nồng độ 0, 500, 800, 1000 và 2,200 μM. Mẫu tảo được lấy hàng ngày và lọc qua màng lọc với kích thước lỗ 0,45 μm để loại sinh khối và được đựng trong các vials và bơm vào bộ phận phá mẫu bằng phương pháp đốt ở nhiệt độ 950 oC tạo ra CO2 và phát hiện bằng dầu dò cảm biến hồng ngoại (Nondispersive Infrared Detector, NDIR). Nồng độ DIC được tính bằng phương trình quan hệ tuyến tính giữa nồng độ NaHCO3 và diện tích peak CO2 phát hiện.
Thành phần carbon trong sinh khối tảo được phân tích bằng máy phân tích nguyên tố CHNSO Analyzer (2400 CHNS/O Series II System, PerkinElmer, Mỹ). Mẫu sinh khối tảo được sấy trong tủ sấy ở 105 oC đến khối lượng không đổi để loại bỏ ẩm và cân 1-5 mg vào vial đựng mẫu. Mẫu được đốt với nguồn oxy sạch (≥99,9%) dưới nhiệt độ 920 – 980 oC trong điều kiện ổn định để tạo ra CO2, H2O và N2. Hệ thống PE-2400 tự động tách và phân tích các thành phần khí bằng đầu dò dẫn nhiệt (thermal conductivity detector, TCD). Hàm lượng C, H, N, O được tính theo hàm lượng C, H, N, O được tạo ra từ chất chuẩn acetanilide (2 – 3 mg) (≥99,5% (CHN), Sigma-Aldrich, Inc., Mỹ).
2.3.4.6. Đánh giá hiệu suất hấp thụ CO2
Thời gian lưu của CO2 trong môi trường nuôi vi tảo trong thiết bị phản ứng được tính theo công thức (4):
V RT=
Q (4) Trong đó, V là thể tích làm việc của thiết bị quang sinh học (L), Q là lưu lượng khí sục (L/phút) và RT là thời gian lưu của khí qua môi trường nuôi vi tảo trong hệ thống thiết bị (phút).
Lượng khí CO2 cố định được tính theo công thức (5): 2 2 CO CO f i C C M F =(X - X )×f ×V× M (5) Trong đó FCO2 là lượng CO2 cố định trong sinh khối tảo tính tại thời điểm thu hoạch (g), Xf và Xi tương ứng là nồng độ sinh khối tảo đo được tại thời điểm
thu hoạch và thời điểm đầu của quá trình nuôi cấy (g/L), fC là thành phần cacbon trong sinh khối tảo (g/g), V là thể tích làm việc của thiết bị (L), MCO2 là khối lượng mole của CO2 (g/mole) và MC là khối lượng mole của cacbon (g/mole).
Tốc độ cố định CO2 được tính theo công thức (6).