Hiện nay có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng rong biển có hoạt tính sinh học cao và phong phú như khả năng chống oxy hóa, chống đông tụ máu, kháng vi sinh vật kiểm định và tăng khả năng miễn dịch. Thêm nữa, rong biển còn được biết đến là có nhiều tác dụng sinh học khác như tác dụng hạ mỡ
máu, giảm cholesterol, giảm LDL-cholesterol, triglyceride máu, tăng HDL- cholesterol, điều chỉnh miễn dịch. Những hoạt tính nêu trên đã được các nhà khoa học chứng minh ở các mô hình thí nghiệm in vitro và in vivo. Do vậy,
rong biển có giá trị và có khả năng sử dụng làm vật liệu sinh học trong những lĩnh vực y dược.
Năm 2010, L.S.Costa và cộng sự đã nghiên cứu các polysaccharide sulfat từ 11 loài rong biển nhiệt đới để đánh giá các hoạt tính chống đông máu, chống oxy hóa và kháng viêm. Nghiên cứu này nhấn mạnh tiềm năng chống oxy hóa lớn của bốn loài: Caulerpa sertularioide; Dictyota cervicornis; Sargassum filipendula và Dictyopteris ophiatula. Sau 72 giờ ủ,
sự tăng sinh tế bào HeLa bị ức chế (p <0,05) từ 33,0% đến 67,5% bởi S. filipendula; 31,4% và 65,7% bởi D. ophiatula; 36,3% và 58,4% bởi C. sertularioide tăng sinh và 40,2% và 61,0% bởi D. cervicornis ở nồng độ
0,01–2 mg/ml polysaccharide chiết từ các loại rong này. Hiệu quả của các polysaccharide này tỷ lệ thuận với hàm lượng sulfat (r=0,934). Một số polysaccharide đã chứng minh tiềm năng chống oxy hóa, kháng viêm hoặc chống đông máu. Các polysaccharide này đã được chọn cho các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học, phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Các polysaccharide từ các loài này cũng được tiến hành thử nghiệm in vivo trong tương lai [34].
Năm 2014, nhóm tác giả A. Pushparaj, T. Kallikulam ở Ấn Độ đã khảo sát hoạt tính của loài rong lục Caulerpha sertularioid với 5 dịch chiết trong các dung môi khác nhau gồm acetone, chloroform, ethanol, ethyl acetate và methanol. Nghiên cứu này cho thấy khả năng kháng khuẩn đáng kể đối với sáu loại vi khuẩn gây bệnh bao gồm Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Lactobacillus acidophilus, Pseudomonas aeruginosa, escherichia coli. và
Proteus mirabilis ở nồng độ 100 µg/ml. Ở nồng độ 40 µg/ml, các hoạt tính
cao nhất được thấy trong cao chiết ethanol đối với các loài B. subtilis, E. coli và Proteus mirabilis tương ứng đường kính kháng khuẩn là 6mm, 6mm và
7mm [35].
Năm 2016, tác giả Thành Thị Thu Thủy và các cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc của dịch chiết ulvan thu được từ rong lục Ulva lactuca thu tại Việt
Nam và đánh giá tác dụng gây độc tế bào của nó đối với ba dòng tế bào ung thư gan, ung thư vú và ung thư cổ tử cung ở người. Kết quả của nghiên cứu cho thấy dịch chiết ulvan bao gồm rhamnose/ galactose/ xylose/ manose/ glucose (với tỷ lệ số mol 1: 0,03: 0,07: 0,01: 0,06), acid uronic (21,5 %) và hàm lượng sulfat (18,9%). Ulvan này chủ yếu bao gồm disaccharide[→4)-β- d-GlcA-(1→4)-α-l-Rha3S-(1→] và disaccharide nhỏ khác β-GlcA- (1→2)-α- Xyl và β-GlcA- (→ 2)-α-Rha. Ulvan cho thấy hoạt động gây độc tế bào đáng kể chống lại ung thư biểu mô tế bào gan với giá trị IC50 29,67±2,87 μg/ml, ung thư vú ở người là 25,09±1,36 μg/ml và ung thư cổ tử cung là 36,33±3,84 μg/ml [36].
Năm 2017, Hadeel JawadAl Houri và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của rong nâu và rong lục thu thập từ biển Đỏ. Các chất chiết xuất từ dịch chiết methanol và axeton đã được thử nghiệm chống lại vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm Candida albicans nhằm tìm ra các hợp chất
mới có khả năng thay thế cho các loại thuốc kháng sinh thông thường. Dịch chiết methanol của cả hai loài rong biển nâu S. latifolium B và S. platycarpum A được phát hiện có hoạt tính chống lại vi khuẩn gram dương mạnh hơn gram âm. Tuy nhiên, dịch chiết aceton của S. latifolium cho hoạt tính ức chế cao nhất đối với Salmonella sp. Mặt khác, dịch chiết mẫu khô của C. socialis cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với chiết xuất tươi nhưng dịch chiết tổng loài này có hoạt tính yếu hơn so với các loài thuộc chi Sargassum. Chiết xuất cao tổng của các mẫu cho thấy tác dụng rõ ràng đối với vi khuẩn tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA). Nghiên cứu này cho thấy hiệu quả điều trị của rong biển tương đương với các kháng sinh đã được thử nghiệm trong việc của các mẫu nghiên cứu cũng cao hơn đáng kể được ghi nhận ở loài
Sargassum sp. so với Cladophora sp [37].
Năm 2020, Nguyễn Thế Hân và các cộng sự đã nghiên cứu đáng giá hoạt tính ức chế α-glucosidase của 3 loài rong lục (Halimeda macroloba, Ulva
reticulata và Ulva lactuca) thu mẫu tại vùng biển Khánh Hòa và kết quả
nghiên cứu cho thấy, hoạt tính ức chế α-glucosidase của 3 loài H. macroloba, U. reticulata và U. lactuca giá trị IC50 lần lượt là 3,98 mg/ml; 4,76 mg/ml và 5,21 mg/ml. Ảnh hưởng của thời gian chiết và nhiệt độ chiết
đến hoạt tính ức chế α-glucosidase của loài rong lục H. macroloba được nghiên cứu thích hợp tương ứng ở 60 phút chiết và 60°C. Trong các phân đoạn dung môi chiết, phân đoạn ethyl acetate có hoạt tính ức chế α- glucosidase cao nhất (giá trị IC50 là 2,45 mg/ml), tiếp theo là n-hexane, butanol và nước với giá trị IC50 lần lượt là 2,79 mg/ml; 4,11 mg/ml và 4,91 mg/ml. Kết quả nghiên cứu định tính cho thấy phân đoạn ethyl acetate của loài rong lục H. macroloba có mặt của các nhóm chất phenolic, flavonoid và terpenoid [38].
CHƯƠNG II:NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Trong báo cáo này 9 mẫu rong lục (Chlorophyta) được PGS.TS Đàm Đức Tiến thu thập và giám định tên khoa học. Các mẫu được thu tại vùng biển Nha Trang, Trường Sa của tỉnh Khánh Hòa và Côn Đảo của tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu. Thời gian thu mẫu từ tháng 6 đến tháng 7 năm 2017, mẫu tiêu bản được lưu tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Viện Nghiên cứu hệ Gen.
Bảng 2.1. Danh sách mẫu rong lục nghiên cứu
TT Tên khoa học Kí hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu Thời gian
thu mẫu Ảnh tiêu bản
1 Halimeda discoidea Decaisne 5KT Côn Đảo 6/2017 2 Chaetomorpa capillaris (Kuetz.) Borg. 15KT Côn Đảo 6/2017
TT Tên khoa học Kí hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu Thời gian
thu mẫu Ảnh tiêu bản
3 Ulva compressa Linnaeus 4KT Côn Đảo 6/2017 4 Ulva fasciata
Delile 4A Nha Trang 6/2017
5 Caulerpa racemosa (Forsk.) J. Ag. 4B Nha Trang 7/2017 6 Halimeda discoidea Decaisne 15B Nha Trang 7/2017
TT Tên khoa học Kí hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu Thời gian
thu mẫu Ảnh tiêu bản
7 Valonia fastigiata Harv. 3B Nha Trang 7/2017 8 Caulerpa sertularioides (Gmelin) Hown 5B Nha Trang 7/2017 9 Halimeda incrassata Lamouroux TSL Trường Sa Lớn Khánh Hòa 7/2017 2.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 2.2.1. Dụng cụ, thiết bị
Máy sắc ký khí Shimadzu GC-2010 (Kyoto, Nhật Bản), cột mao quản Equity 5 (Merck, L× ID 30m × 0,25mm, df 0,25µm), khí mang Heli 20 ml/phút. Chương trình nhiệt độ trong lò hoạt động ở 160°C, tăng 2°C/phút lên
240°C sau đó giữ trong 20 phút. Các acid béo đã được metyl este hóa (FAME) được xác định bằng. Acid béo được xác định qua giá trị thời gian lưu tương đương (ECL) dựa trên thời gian lưu của các chất chuẩn là acid béo C16:0 và C18:0.
Máy LCMS-IT-TOF, Shimadzu, nhiệt độ nguồn 300oC, phạm vi đo m/z 100-1200 (1500), điện thế nguồn ion 4.5kV, khí mang N2 áp suất 25 kPa, tốc độ dòng khí 2 l/phút.
Máy Scan Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Nhật Bản) Cân phân tích Sartorius analylic (10-4), Thụy sỹ.
Máy li tâm Heraeus (5000 vòng/phút), Germany.
Máy cất quay chân không Buchi hệ điều chỉnh tự động, Switzerland. Pipiet 50-1000µl, lọ vial 2-4ml, ống nghiệm và các dụng cụ phổ biến trong phòng thí nghiệm.
2.2.2. Dung môi, hóa chất
CH3OH (PA), CHCl3 (PA), C6H14 (PA), (CH3CH2)2O (PA), Na2SO4, CH3COOH, H2SO4, H2O.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Các mẫu rong biển được thu thập dựa vào quy phạm tạm thời điều tra tổng hợp biển của Uỷ ban Khoa học và Kĩ thuật Nhà nước (phần rong biển), ban hành năm 1980 cho các mẫu thu ở vùng triều. Các mẫu thu ở vùng dưới triều dựa vào tài liệu hướng dẫn của Wilkinson & Baker 1997 [39,40].
Mẫu nghiên cứu sinh - hóa, được rửa sạch bằng nước mặn sau đó rửa bằng nước ngọt và bảo quản bằng tủ lạnh sâu ở -20 oC, mẫu làm tiêu bản được ngâm trong dung dịch formol 5%, mẫu tiêu bản khổ được đặt trên giấy croki sau đó ép trong giấy thấm.
Việc định loại chủ yếu dựa vào các tiêu chuẩn về hình thái ngoài và cấu tạo trong (bằng các tiêu bản lát cắt dưới kính hiển vi Leica với độ phóng đại
1350 lần). Việc phân loại rong biển tuân theo nguyên tắc chung phân loại thực vật theo các nghiên cứu trước đây [41-46].
2.3.2. Xác định độ ẩm của mẫu
Độ ẩm của mẫu được xác định theo dược điển IV, Phụ lục 9.6 mất khối lượng do làm khô [47].
Thực nghiệm: Sấy khô đĩa petri và nắp ở nhiệt độ 105±2 oC đến khối lượng không đổi m0, cân 10g ± 0,01g mẫu trên đĩa đã sấy (m1). Đem mẫu và đĩa sấy ở 105±2oC cho đến khối lượng không đổi trong khoảng 4h. Tiếp tục sấy khô cho đến khi khối lượng giữa 2 lần sấy không vượt quá 0,01g. Sau khi sấy lấy nắp đậy đĩa lại và chuyển qua bình hút ẩm để làm nguội và cân ghi khối lượng là (m2). Hàm lượng ẩm của mẫu được tính như sau:
Trong đó: m0: khối lượng nắp và đĩa (g) m1: khối lượng nắp + đĩa + mẫu (g)
m2: khối lượng nắp + đĩa + mẫu sau khi sấy khô (g) 2.3.3. Xác định hàm lượng tro toàn phần
Hàm lượng tro toàn phần được xác định theo dược điển IV, Phụ lục 9.8 [47]. Thực nghiệm: Cân 5g mẫu chính xác tới 0,01g vào chén nung bằng sứ có nắp đã sấy đến khối lượng không đổi và xác định khối lượng. Đậy nắp chén nung và đốt sơ bộ trên bếp điện. Sau khi mẫu đã cháy thành than, chuyển chén nung chứa mẫu sang lò nung ở nhiệt độ 600- 700oC. Mẫu được tro hóa tới màu trắng xám hoặc vàng nhẹ, lấy kẹp gắp chén nung đặt trong bình hút ẩm khoảng 40-60 phút, cần xác định khối lượng chén nung chứa tro của mẫu chính xác tới 0,01g.
Tính kết quả: hàm lượng tro theo phần trăm (X1) tính bằng công thức:
0 1 1 ( - G) x 100 ( - G) = G X G
Trong đó:
G0: Khối lượng của chén (g)
G1: Khối lượng của chén + Khối lượng của mẫu thử (g)
G2: Khối lượng của chén + Khối lượng tro trắng sau khi đã nung (g). 2.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số
Xác định hàm lượng protein tổng số được thực hiện theo phương pháp Kjeldahl 1883 [48].
Thực nghiệm: Cân từ 1,0 đến 1,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 0,01mg chuyển vào bình Kjeldahl khô. Thêm 10g hỗn hợp xúc tác vào trộn đều sau đó bổ sung 20 ml acid sulfuric 98%, xoay nhẹ bình để trộn và làm ẩm lượng mẫu chứa trong bình. Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt. Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp trong 30 phút. Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl. Để nguội dịch phân hủy (dịch A). Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng acid dư đã bị thất thoát trong quá trình phân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi.
Pha loãng dịch A với 250 ml nước cất và thêm từ từ khoảng 70 ml dung dịch natri hydroxit để tạo thành hai lớp rõ rệt. Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng. Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch acid boric. Chưng cất amoniac vào lượng dư acid boric nồng độ 20 g/lít (khoảng 25 ml), có chứa 0,5 ml chất chỉ thị. Lấy khoảng 180 ml dịch chưng cất và chuẩn độ amoniac bằng dung dịch acid chuẩn độ. Điểm kết thúc chuẩn độ đạt được khi dung dịch chuyển sang màu xám.
Hàm lượng protein tổng số
Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (1):
(1)
Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô, được tính theo Công thức (2):
(2) Trong đó:
V là thể tích dung dịch acid chuẩn độ cần để trung hòa amoniac sau khi trừ giá trị tương ứng của mẫu trắng, tính bằng mililit (ml);
0,0014 là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch acid chuẩn độ (acid clohydric 0,1 M hoặc acid sulfuric 0,05 M);
M là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
W là độ ẩm của phần mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng, xác định được theo TCVN 10788:2015.
Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (3):
XP1 = XN1 x 6,25 (3)
Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô, được tính theo Công thức (4):
XP2 = XN2 x 6,25 (4) Trong đó:
XN1 là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng, theo Công thức (1);
XN2 là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng chất khô, theo Công thức (2);
6,25 là hệ số chuyển đổi từ hàm lượng nitơ tổng số sang hàm lượng protein. ( 1) V x 0.0014 V x 0.14 x 100 = = N X m m ( 2) V x 0.0014 100 V x 14 x x 100= 100 w x (100-w) = - N X m m
2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate
Phương pháp acid phenol – sulfuric là phương pháp xác định nồng độ carbohydrate [49].
Nguyên tắc: Dùng acid sunfuric đặc để khử nước, tạo ra các dẫn xuất furfural. Phản ứng tiếp theo giữa các dẫn xuất furfural và phenol tạo ra màu có thể tách rời.
Tiến hành: Lấy 1g mẫu trộn với 2 ml dung dịch phenol 5% trong một ống nghiệm. Tiếp theo ta thêm nhanh 5 ml acid sulfuric đặc. Để ống nghiệm yên trong 10 phút, tiếp theo lắc nhẹ trong 30s và được đặt trong nồi cách thủy ở nhiệt độ phòng 20 phút để màu phát triển. Sau đó, lấy dung dịch đo trên máy quang phổ ở bước sóng 490 nm. Các dung dịch đối chiếu được chuẩn bị theo cách tương tự như trên nhưng thay 2 ml dung dịch carbohydrate bằng dung dịch milipore. Phenol được sử dụng trong quy trình này đã được chưng cất lại và 5% phenol trong nước (w/w) đã được chuẩn bị ngay trước khi đo. 2.3.6. Phương pháp chiết lipid tổng
Các mẫu rong biển được chiết lipid tổng theo phương pháp của Bligh and Dyer (1959) [50]. Đây là phương pháp thường quy được sử dụng cho mẫu biển tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam (sơ đồ hình 2.1).
Thực nghiệm: 50g mẫu tươi được xay hoặc cắt nhỏ, chiết với 150ml hỗn hợp dung môi CHCl3/CH3OH, kết hợp siêu âm ở 400C trong 2 giờ. Toàn bộ dịch chiết được lọc ra, phần bã được chiết lại một lần nữa với 150ml CHCl3. Dịch chiết của 2 lần được gộp lại và bổ sung thêm 100ml H2O, lắc mạnh, sau đó để lắng đến khi toàn bộ hỗn hợp dịch chiết được phân thành hai lớp. Pha dưới chứa lipid tổng được chiết ra, làm khan bằng Na2SO4, lọc bỏ muối, dịch chiết được cô quay loại bỏ dung môi. Hàm lượng lipid tổng tính theo phần trăm so với lượng mẫu ban đầu đem chiết. Lipid tổng được bảo quản trong CHCl3 tinh khiết ở nhiệt độ -20oC.
Sơ đồ 2.1. Thực nghiệm chiết lipid tổng
2.3.7. Phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid
Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid được phân tích và xác định trên bản mỏng tráng sẵn (6cm × 6cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga). Dịch chiết lipid tổng được thổi kiệt dung môi bằng khí argon, bổ sung CHCl3 phân tích (nồng độ 10 mg/ml), chấm điều chế trên bản mỏng 3 vệt theo nồng độ tăng dần. Cho bản mỏng chạy triển khai trong hệ dung môi C6H14:(CH3CH2)2O:CH3COOH, để khô sau đó cho chạy lần 2 trong hệ CHCl3:MeOH/40:60. Sử dụng thuốc thử H2SO410%/MeOH, sấy bản mỏng ở 110-220oC. Scan trên máy Epson perfection 2400 PHOTO với độ phân giải và