Từ lâu trên thế giới, việc định lƣợng saccharin và các muối của nó đã đƣợc quan tâm rộng rãi. Nhiều phƣơng pháp định lƣợng sử dụng các kỹ thuật phân tích khác nhau đã đƣợc áp dụng, từ đơn giản và cổ điển nhƣ tạo dẫn xuất chuyển hóa N- bromo và đo quang hay phƣơng pháp đo phổ tƣ ngoại đạo hàm cho đến các phƣơng pháp phức tạp và hiện đại nhƣ phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp đầu dò tán xạ bay hơi (E SD), HPLC kết hợp đầu dò CAD (charged aerosol detector) nối tiếp UV-Vis,… Các quy trình xử lý mẫu đƣợc áp dụng có thể đơn giản nhƣ chiết lỏng-lỏng với dung môi hữu cơ, chiết siêu âm, làm giàu mẫu qua SPE hoặc phức tạp bằng cách kết hợp nhiều phƣơng pháp qua nhiều bƣớc, tùy theo nền mẫu phân tích là nƣớc ngọt, bánh kẹo, nƣớc trái cây, yaourt,… Tuy nhiên, nhìn chung, các công trình nghiên cứu đƣợc công bố đều tiến hành phân tích đồng thời natri saccharin và một số phụ gia thực phẩm khác nhƣ aspartame, acesulfame-K, sucralose, natri benzoate, axit citric, … iều này cũng là do xu hƣớng sử dụng đồng thời nhiều chất phụ gia cùng lúc trong thực phẩm hiện nay [8], [10], [11], [15], [16].
Chƣơng III. PHƢƠNG PH P L MẪU VÀ PH N T CH CHẤT PHỤ GIA NATRI SACCHARIN
3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu
Do ảnh hƣởng của chất nền, quá trình định lƣợng các chất phụ gia thực phẩm trong hầu hết các trƣờng hợp cần bƣớc xử lý mẫu trƣớc khi phân tích. Các mẫu thực phẩm đƣợc đặc trƣng bởi sự phức tạp của nền mẫu. Carbohydrate, protein, lipid, khoáng chất, chất bảo quản, màu, chất làm đặc và vitamin có thể tồn tại riêng lẻ hoặc song song trong một nền mẫu thực phẩm, vốn có thể ảnh hƣởng đến việc xác định saccharin. Quy trình xử lý mẫu chủ yếu bao gồm ba bƣớc. Thứ nhất, mẫu cần đƣợc làm đồng nhất. Thứ hai, saccharin đƣợc chiết xuất từ nền mẫu thực phẩm. Thứ ba, làm sạch thêm dịch chiết trƣớc khi phân tích. Bƣớc thứ tƣ và bƣớc cuối cùng (nếu cần) có thể là cô đặc trƣớc phần chiết xuất và pha loãng lại với dung môi thích hợp.
Một số phƣơng pháp làm sạch mẫu phổ biến bao gồm chiết pha rắn (SPE), thẩm tách, chiết lỏng-lỏng (LLE), kết tủa và lọc. Mẫu có thể cần ly tâm trƣớc khi phân tích để đƣợc làm sạch tốt hơn Trong đó, phƣơng pháp SPE là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất hiện nay. Kỹ thuật chiết pha rắn phân đoạn các hợp chất phân tích dựa trên ái lực của chúng với pha tĩnh Quy trình chiết pha rắn cơ bản chủ yếu bao gồm bốn bƣớc. ầu tiên là nhồi và cân bằng cột, tiếp theo là nạp dịch chiết thực phẩm, rửa giải các chất nhiễu và cuối cùng là rửa giải các chất phân tích với các loại dung môi thích hợp. Các thông số khảo sát cần lƣu là loại pha rắn, dung môi, độ pH và tốc độ rửa giải.
Trong các nghiên cứu định lƣợng saccharin đƣợc công bố, nhiều loại nền mẫu thực phẩm đã đƣợc xử lý thích bằng các phƣơng pháp thích hợp trƣớc khi phân tích. Nƣớc giải khát Cola thƣờng đƣợc khử khí trong bể siêu âm (Demiralay và cộng sự, 2006). Quy trình tƣơng tự cũng áp dụng cho đa số đồ uống có ga. Quá trình khử khí đƣợc thực hiện bằng siêu âm, sục khí nitơ hoặc
trong môi trƣờng chân không. Các mẫu kẹo cao su đƣợc chiết bằng hỗn hợp axit axetic băng, nƣớc và cloroform. Các mẫu kẹo cứng hoặc mềm đƣợc lắc với nƣớc cho đến khi hòa tan (Biemer, 1989). Sữa và các sản phẩm từ sữa đƣợc đồng nhất trƣớc khi phân tích và pha loãng với nƣớc cất. Hỗn hợp đƣợc khuấy kỹ và sau đó lọc (Ni và cộng sự, 2009) Saccharin đƣợc xác định trong các loại mứt ăn kiêng bằng cách trộn với nƣớc và đun Sau đó, hỗn hợp đƣợc pha loãng đến một thể tích nhất định và lọc (Boyce, 1999). Mẫu trái cây đã qua xử lý bảo quản đƣợc xay nhuyễn và đồng nhất Sau đó, nƣớc đƣợc thêm vào và hỗn hợp tạo thành đƣợc chiết xuất bằng sóng siêu âm và pha loãng với nƣớc đến một thể tích nhất định (Chen và cộng sự, 2001). Khi phân tích mẫu nƣớc trái cây, cần phải thực hiện bƣớc ly tâm trƣớc khi lọc. Các nền mẫu tƣơng đối đơn giản nhƣ chất làm ngọt lỏng, có thể chỉ cần pha loãng hoặc hòa tan trong nƣớc khử ion hoặc trong dung dịch đệm thích hợp [7], [8], [11], [13].
3.2. Phƣơng pháp phân tí h hất phụ gia natri saccharin
Ba tham số chính và quan trọng nhất để lựa chọn phƣơng pháp phân tích : - Thuốc thử và thiết bị sử dụng phải sẵn có và có giá thành thấp;
- Phƣơng pháp đủ độ nhạy với giới hạn phát hiện thấp, vì các chất tạo ngọt thƣờng tồn tại trong thực phẩm với nồng độ vi lƣợng;
- Lƣợng mẫu và thuốc thử sử dụng phải tƣơng đối thấp.
Một số kỹ thuật phân tích natri saccharin đáp ứng các yêu cầu trên bao gồm cảm biến sinh học, đo quang phổ, sắc k , phân tích điện.
Cảm biến sinh học cung cấp khả năng phát triển các phƣơng pháp sàng lọc nhanh saccharin với chi phí thấp (Nikolelis và cộng sự, 2000). Màng lipid có thể đƣợc sử dụng để phát hiện nhanh hoặc theo dõi liên tục nhiều loại hợp chất trong thực phẩm. Sự nhiễu từ protein có thể đƣợc loại bỏ bằng cách điều chế dung dịch chất mang không cho phép hấp phụ các hợp chất này trong màng lipid kép (Nikolelis và cộng sự, 2001). Một phƣơng pháp đo độ dẫn điện dựa trên việc sử
dụng màng lipid kép ổn định bề mặt (s-B M) đã đƣợc phát triển để theo dõi saccharin và các chất tạo ngọt khác. Sự tƣơng tác của chất tạo ngọt với s-BLM tạo ra sự gia tăng tín hiệu dòng ion điện hóa có thể tái tạo xuất hiện trong vòng vài giây sau khi màng tiếp xúc với chất tạo ngọt (Nikolelis và cộng sự, 2001). Sau đó, một cảm biến màng nanohybrid đã đƣợc nghiên cứ (BLM nhân tạo) và so sánh với màng lipid kép ổn định bề mặt (s-BLM) cho kết quả mang lại độ ổn định cao hơn (Chalkias và cộng sự, 2007).
Phép đo quang phổ là một kỹ thuật phát hiện đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định chất tạo ngọt. Nhƣợc điểm của kỹ thuật này là sự nhạy cảm với nhiễu trong nền mẫu phụ gia thực phẩm. Một số phƣơng đã đƣợc đề xuất để khắc phục những hạn chế của nhiễu nền nhƣ tạo dẫn xuất với Nile Blue (Cordoba và cộng sự, 1985), kết hợp với hệ thống FIA (Phân tích dòng chảy) (Capitán-Vallvey và cộng sự, 2006) hoặc phƣơng pháp đo quang phổ dựa trên phản ứng oxy hóa của saccharin với KMnO4 (Ni và cộng sự, 2009).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HP C) thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích mẫu thực phẩm. Quy trình phân tích saccharin trong thực phẩm sử dụng phƣơng pháp HPLC khá đơn giản, vì đồ uống hoặc chất chiết xuất lỏng từ thực phẩm thƣờng có thể đƣợc tiêm vào cột ngay sau khi lọc Phƣơng pháp đƣợc áp dụng phổ biến nhất để xác định saccharin là HPLC pha đảo kết hợp với đầu dò UV, tiêu biểu là nghiên cứu của awrence và Charbonneau đề xuất vào năm 1988 Cột C8 với kích hạt nhồi 5 μm, kích thƣớc 150 mm x 4,6 mm đƣợc sử dụng làm pha tĩnh trong nghiên cứu này. Pha động đƣợc rửa giải ở chế độ gradient nằm trong khoảng từ 3% acetonitril trong 0,02M KH2PO4 (pH 5) đến 20% acetonitril trong 0,02M KH2PO4 (pH 3,5) với tốc độ dòng không đổi 1,0 mL/phút, bƣớc sóng phát hiện là 210 nm (Lawrence và cộng sự 1988).
iện di mao quản (CE) là một giải pháp thay thế thú vị cho HPLC. Khả năng phân tích của kỹ thuật này là tƣơng đƣơng với HPLC. Các loại điện di mao
quản (CE) khác nhau đã đƣợc sử dụng nhƣ sắc k điện động vi sao (MEKC) (Boyce và cộng sự 1999), điện di mao quản (CITP) (Herrmanová và cộng sự 2006) [9], [10], [12], [14], [15], [16], [17].
KẾT LUẬN
Nhóm chất phụ gia thực phẩm tạo ngọt saccharin nói chung và natri saccharin nói riêng đã đƣợc chứng minh là an toàn cho ngƣời dùng khi đƣợc sử dụng ở nồng độ khuyến cáo (ADI: 0-5 mg/kg thể trọng). Tuy nhiên, việc sử dụng phổ biến có thể dẫn đến vấn đề lạm dụng hoặc quá liều trong cuộc sống hàng ngày. Vì vậy, việc kiểm soát hàm lƣợng natri saccharin là hết sức cần thiết.
Việc xác định saccharin riêng lẻ hoặc đồng thời với các chất tạo ngọt khác trong thực phẩm là rất quan trọng đối với sự an toàn của ngƣời tiêu dùng. Các phƣơng pháp phân tích đƣợc phát triển với tiêu chí có độ nhạy cao, đơn giản, nhanh chóng và chi phí thấp Ngày nay, phƣơng pháp đƣợc ƣu tiên lựa chọn để xác định chất tạo ngọt nhân tạo trong các nền thực phẩm phức tạp khác nhau là HPLC vì khả năng đa phân tích, tính tƣơng thích với các đặc tính hóa lý của chất tạo ngọt, cũng nhƣ độ nhạy và độ bền cao. Bên cạnh đó, kỹ thuật cảm biến sinh học cũng đƣợc áp dụng trên nên mẫu đơn giản hơn với giá thành rẻ hơn và quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản. Trong tƣơng lại, do nhu cầu liên tục tăng lên đối với các phƣơng pháp thay thế để xác định saccharin, việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại hơn nhƣ phƣơng pháp khối phổ hoặc khối phổ song song là một hƣớng đi đang mong đợi.
Việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho từng chất phân tích đòi hỏi sự đánh giá về khả năng của đơn vị để đảm bảo tính khả thi nhƣng vẫn phải đạt yêu cầu bằng hoặc cao hơn các kỹ thuật phân tích trong tài liệu chính tắc, cũng nhƣ phƣơng pháp cần đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn sau khi phát triển.
Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất phƣơng pháp xác định chất phụ gia thực phẩm natri saccharin trong mẫu nƣớc ngọt có ga bằng phƣơng pháp HP C ghép đầu dò PD nhƣ sau:
- Cột: Thermo Hypersil C18 (150 4,6 mm ID, 5 m) hoặc tƣơng đƣơng - Pha động: nƣớc – methanol, điều chỉnh ở các tỷ lệ khác nhau.
- Detector: PD , bƣớc sóng 210 nm. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Dung môi pha mẫu: nƣớc tinh khiết đạt chuẩn sắc ký
* Pha dung dịch thử:
Mẫu nƣớc ngọt có ga đƣợc loại khí trong bể siêu âm trong 30 phút (nhiệt độ phòng) và pha loãng với nƣớc dung môi pha mẫu ở tỷ lệ 1:10.
* Pha dung dịch đối chiếu:
Cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn natri saccharin cho vào bình định mức 100 ml. Bổ sung vừa đủ thể tích bằng dung môi pha mẫu. Dung dịch này đƣợc pha loãng liên tiếp với dung môi pha mẫu để có đƣợc nồng độ cần thiết. Tất cả các dung dịch đƣợc bảo quản ở nơi tối, mát mẻ khi không sử dụng. Các mẫu đƣợc lƣu trữ không quá 14 ngày.
* Tiến hành:
- Triển khai hệ thống sắc ký hoạt động ổn định.
- Kiểm tra tính tƣơng thích hệ thống trên dung dịch đối chiếu: ộ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic natri saccharin trong 6 lần tiêm lặp lại mẫu đối chiếu không đƣợc lớn hơn 2,0%, số đĩa l thuyết > 2000, hệ số bất đối 0,8 < As < 1,5.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt
1. QCVN 4-8:2010/BYT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – chất ngọt tổng hợp
2. QCVN 4-28:2010/BYT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm natri saccharin
3. TCVN 10030:2013 – Thực phẩm - xác định saccharin trong các chế phẩm tạo ngọt - phương pháp đo phổ
4. TCVN 10033:2013 – Thực phẩm - xác định cyclamate và saccharin trong các chế phẩm tạo ngọt dạng lỏng – phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 5. Thông tƣ 24/2019/TT-BYT - Quy định về quản lý và sử dụng phụ gia thực phẩm
Tài liệu tiếng nƣớ ngoài
6. Ammar A.Razzak Mahmood, Sahar B. Al-Juboori. A review: Saccharin discovery, synthesis, and application. Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. 33 (2) 2020
7. Biemer T.A. 1989. Analysis of saccharin, acesulfame-K and sodium cyclamate by high performance ion chromatography. J. Chromatogr. 463:463- 8.
8. Boyce M.C. 1999. Simultaneous determination of antioxidants, preservatives and sweeteners permitted as additives in food by mixed micellar electrokinetic chromatography. J. Chromatogr. A. 847:369-75.
9. Capitán-Vallvey L.F., Valencia M.C., Nicolás E. Arana, et al. 2006. Resolution of an intense sweetener mixture by use of a flow injection sensor with on-line solid-phase extraction-Application to saccharin and aspartame in sweets and drinks. Anal. Bioanal. Chem. 385: 385–91.
10. Chalkias N.G., Giannelis E.P. 2007. A nanohybrid membrane with lipid bilayer-like properties
11. Chen Q.C., Wang J. 2001. Simultaneous determination of artificial sweeteners, preservatives, caffeine, theobromine and theophylline in food and pharmaceutical preparations by ion chromatography. J. Chromatogr. A.
937:57–64.
12. Cordoba M. Hernandez, Garcia I. Lopez, Sanchez-Pedreño C. et al. 1985. Spectrophotometric determination of saccharin in different materials by a solvent extraction method using Nile blue as reagent. Talanta. 32:325-7. 13. Demiralay E.Çubuk, Özkan G., Guzel-Seydim Z. 2006. Isocratic separation of some food additives by reversed phase liquid chromatography.
Chromatographia. 63:91–6.
14. Lawrence J.F., Charbonneau C.F., 1988. Determination of seven artificial sweeteners in diet food preparations by reverse phase liquid chromatography with absorbance detection. J. AOAC. 71:934–7.
15. Nikolelis D.P., Pantoulias S. 2000. A minisensor for the rapid screening of acesulfame-K, cyclamate, and saccharin based on surface stabilized bilayer lipid membranes. Electroanal. 12:786-90.
16. Nikolelis D.P., Pantoulias S. 2001b. Selective Continuous Monitoring and Analysis of Mixtures of Acesulfame-K, Cyclamate, and Saccharin in Artificial Sweetener Tablets, Diet Soft Drinks, Yogurts, and Wines Using Filter- Supported Bilayer Lipid Membranes. Anal. Chem. 73:5945-52.
17. Nikolelis D.P., Pantoulias S., Krull U.J., et al. 2001a. Electrochemical transduction of the interactions of the sweeteners acesulfame-K, saccharin and cyclamate with bilayer lipid membranes (BLMs). Electrochim. Acta. 46:1025– 31.