1. Nguyên tắc
Việc định tính thành phần dung dịch bằng sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng dựa trên khả năng phân tách các cấu tử có trong dung dịch khi pha động dịch chuyển – phân bố các cấu tử trên pha tĩnh theo những hệ số phân bố khác nhau.
Đối với mỗi dung môi (pha tĩnh) khác nhau, sự phân bố các cấu tử được đặc trương bởi hệ số phân bố Rf.
2. Mô tả thí nghiệm 2.1. Dụng cụ - Bình triển khai sắc ký
- Bình phun thuốc thử hiện màu - Máy sấy tóc
- Micropipet hoặc ống mao dãn nhỏ để chấm mẫu sắc ký.
2.2. Nguyên liệu, hóa chất
- Mẫu thí nghiệm: Các acid amin chuẩn Arg, Leu, Cys, Pro…và dung dịch mẫu.
- Pha tĩnh: Giấy sắc ký hoặc bản mỏng
- Pha động: Dung môi gồm [Butanol: Acid acetic: H2O] tỷ lệ là [5: 2: 3] tỉ lệ theo thể tích. Lượng sử dụng là 100ml
- Thuốc thử hiện màu: 0,2 g/ml ninhydrin pha trong acetone.
3. Thực hành
- Chuẩn bị bình sắc ký bằng thủy tinh có nắp kín.
- Pha dung môi làm pha động theo đúng tỷ lệ. Đổ vào bình sắc ký. Đậy kín.
- Chuẩn bị giấy sắc ký hoặc bản mỏng sắc ký. Kẻ đường xuất phát: thẳng, cách mép dưới của bản sắc ký 1,5 – 2 cm. (Lưu ý: kẻ bằng viết chì)
- Sử dụng micropipet hoặc ống mao dẫn chấm mẫu và các dung dịch chuẩn trên đường xuất phát. Khoảng cách giữa các vết chấm chuẩn và mẫu bằng nhau (không chấm vào cạnh mép của bảng mỏng). Làm đậm mẫu hay chuẩn bằng cách chấm nhiều lần (4-5 lần) tại một vị trí chấm (sấy khô nhẹ sau mỗi lần chấm). Lưu ý: 1 ống mao dẫn chỉ sử dụng cho 1 chất khi chấm.
Yêu cầu vết chấm mẫu:
Khoảng cách giữa các chấm từ 1-2cm. Vết chấm gọn, đường kính không quá 0,5cm.
Dùng máy sấy nhẹ đến khô để vết chấm gọn và không bị loang.
Triển khai sắc ký
17
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
Cho pha động vào bình, sao cho bề cao chất lỏng là 1-1,5cm
Đặt giấy sắc ký hoặc bản mỏng sắc ký đã chấm mẫu hay chuẩn vào trong bình (Lưu ý: phần chấm không được cọ xát vào thành bình để tránh nhiễu khi triển khai sắc ký).
Đậy nắp bình sắc ký
Khi pha động đã triển khai hết chiều dài giấy sắc ký hoặc bản mỏng (khoảng cách cách mép giấy còn khoảng 1,5 – 2cm), mở bình sắc ký, lấy bản sắc ký ra để khô (nhiệt độ phòng) và đuổi dung môi (tiến hành trong tủ hút hoặc nơi thoáng khí).
Thuốc thử
Phun dung dịch ninhydrin 0,2% vào bản mỏng đã được đuổi dung môi – phun đều tay và đúng kỹ thuật, sau đó sấy nhẹ bản mỏng bằng máy sấy tay để hiện màu acid amin.
Bình và bảng mỏng đang triển khai sắc ký
x: đoạn đường di chuyển của chất y: đoạn đường di chuyển của dung môi
18
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
Sơ đồ khối thí nghiệm
Chuẩn bị pha động Chuẩn bị bản mỏng - sắc ký
19
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
4. Kết quả
Kết quả sắc ký
Độ dài sắc ký Lo = 7,0 cm
Quãng đường chất M1 trong mẫu Lm1 = 1,5 cm
Quãng đường chất M2 trong mẫu Lm2 = 2,0 cm
Quãng đường chất M3 trong mẫu Lm3 = 2,2 cm
Quãng đường chất M4 trong mẫu Lm4 = 3,2 cm
Quãng đường chất M5 trong mẫu Lm5 = 4,5 cm
Quãng đường chất chuẩn Arginin La = 1,5 cm
Quãng đường chất chuẩn Threonine Lt = 2,2 cm
Quãng đường chất chuẩn Leucine Ll = 4,5 cm
20
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
5. Nhận xét
- Ta thấy quãng đường đi được của các chất M1, M3, M5 trong mẫu tương ứng sấp xỉ bằng quãng đường đi được của các chất chuẩn Arginine, Threonine, Leucine (Lm1 = La = 1,5 cm; Lm3 = Lt = 2,2 cm; Lm5 = Ll = 4,5 cm).
- Các vết của các cặp chất trong mẫu và chất chuẩn tương ứng M1 – Arginine; M3 – Threonine; M5 – Leucine; có màu sắc tương đối giống nhau nhưng hình dạng dạng không tương đồng, trong đó:
Vết của cặp chất M1 – Arginine có màu đỏ và có sai lệch hình dạng nhiều nhất.
Vết của cặp chất M3 – Threonine và M5 – Leucine có màu nâu nhạt và có sai lệch hình dạng tương đối ít (tròn và oval).
Sự không tương đồng về hình dạng vết này có thể giải thích là do thao tác không đồng nhất giữa các lần, gây sai khác về lượng và hình dạng của giọt khi chấm bằng ống mao dẫn trên giấy sắc ký. Bên cạnh đó cũng có thể do kích thước (đường kính) và hình dạng đầu ống mao dẫn (mẻ, gãy…) gây ra những khác biệt về hình dạng và kích thước vết sắc ký.
- Đối với chất M2 trong mẫu ta không tìm được vết của chất chuẩn có quãng đường sắc ký, hình dạng và màu sắc tương ứng gần với nó để tiến hành so sánh.
- So sánh Rf của hỗn hợp acid amin và các acid amin chuẩn:
Rfa = Rfm1 = 1,5/7,0 = 0,21 Rft = Rfm3 = 2,2/7,0 = 0,31 Rfl = Rfm5 = 4,5/7,0 = 0,64
- Từ quãng đường, màu sắc, hình dạng, kích thước của các vết sắc ký của các chất chuẩn và mẫu ta có thể kết luận các chất trong mẫu có thể là:
M1: Arginine M3: Threonine M5: Leucine
Riêng đối với M2 và M4 do những tính chất về quãng đường, màu sắc, kích thước của vết sắc ký ta có thể dự đoán tương ứng là acid amin thứ 4 có độ phân cực nằm giữa Arginine và Threonine (Lm2 = 2,0 cm) và acid amin thứ 5 có độ phân cực nằm giữa Threonine và Leucine (Lm4 = 3,2 cm) nhưng do không có chất chuẩn phù hợp để đối chiều nên ta chưa thể kết luận đây là chất gì.
21
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com