Bảng 2.2. Độ thu hồi chấp nhận ở các hàm lƣợng khác nhau theo AOAC
TT Hàm lƣợng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)
1 100 1 100% 98-102 2 ≥ 10 10-1 10% 98-102 3 ≥ 1 10-2 1% 97-103 4 ≥ 0,1 10-3 0,1 % 95-105 5 0,01 10-4 100 ppm 90-107 6 0,001 10-5 10 ppm 80-110 7 0,0001 10-6 1 ppm 80-110 8 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 9 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 10 0,0000001 10-9 1 ppb 40-120
2.2.2.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ):
*Mục đích:
Xác định giới hạn phát hiện của quy trình phân tích nhằm xác định lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử mà quy trình có thể phát hiện đƣợc.
Xác định giới định lƣợng của quy trình phân tích nhằm xác định đƣợc lƣợng nhỏ nhất cuả chất phân tích trong mẫu thử mà quy trình phân tích có thể định lƣợng đƣợc với độ đ ng và độ chính xác thích hợp.
*Cách tiến hành:
Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng
LOQ đƣợc xác định dựa việc phân tích các mẫu h n hợp chuẩn pha loãng dần . Tiến hành sắc ký h n hợp mẫu chuẩn các parapen đƣợc pha loãng dần đến khi t số S/N đạt yêu cầu hoặc tín hiệu thiết bị không còn đáp ứng.
*Đánh giá kết quả:
- LOD là nồng độ mà tại đó t số tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu S/N ≥ 3 hoặc là nồng độ thấp nhất mà tại đó hình dạng pic và các thông số sắc ký còn đạt yêu cầu.
- LOQ là nồng độ mà tại đó t số tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu S/N ≥ 10 hoặc LOQ = LOD x 3.3
- Dựa vào đƣờng chuẩn:
* Giới hạn phát hiện LOD có thể đƣợc tính nhƣ sau:
* Giới hạn định lƣợng LOQ có thể đƣợc tính nhƣ sau:
Trong đó: σ là độ lệch chuẩn của đáp ứng S là độ dốc của đƣờng chuẩn
2.2.3. Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định trên một số mẫu rượu vang
Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lƣợng 3 mẫu rƣợu vang trên thị trƣờng.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ 3.1. Khảo sát pha ộng và bƣớc s ng phân tích
3.1.1. Kết quả khảo sát pha động
Qua nghiên cứu tài liệu từ những nghiện cứu trƣớc, thấy rằng hệ pha động ACN - H2O có thể tách đồng thời nhiều paraben trên cột pha đảo C18 bằng rửa giải đ ng dòng . Do đó lựa chọn hệ pha động ACN : H2O với nhiều t lệ dung môi khác nhau để khảo sát, bắt đầu từ t lệ 50 :50. Hình 3.1
Hình 3.1. Các t lệ dung môi pha động đƣợc khảo sát: (a) ACN - H2O 50 : 50; (b) ACN - H2O 40 : 60; (c) ACN - H2O 60 : 40
Nhận xét:
- T lệ dung môi pha động ACN - H2O (40 : 60) thời gian phân tích dài, pic của hai paraben bị chẻ ngọn và kéo đuôi.
- T lệ dung môi pha động ACN - H2O (50 : 50) thời gian phân ngắn hơn nhƣng pic của hai paraben vẫn còn bị bị chẻ ngọn
- T lệ dung môi pha động ACN - H2O (60 : 40) thời gian phân ngắn 4 ph t và 6 ph t , pic của hai paraben không còn bị bị chẻ ngọn nhƣng vẫn chƣa cân xứng.
Khi tăng dần t lệ ACN (62, 63, 64. 65, 68, 67 , pic của các parapen cân xứng dần, thời gian rửa giải cũng ngắn dần và các pic có xu hƣớng xát lại gần nhau hơn. Hình 3.2
Hình 3.2. Sắc ký đồ h n hợp chuẩn parapen ở các t lệ: a ACN - H2O (62 : 38); (b) ACN - H2O (63 : 37); (c) ACN - H2O (64 : 36); (d) ACN - H2O (65 :
35); (e) ACN - H2O (66 : 34); (f) ACN - H2O (67 : 33)
Nhận xét: Từ sắc ký đồ trên cho thấy hệ dung môi ACN - H2O (67 : 33) tách tốt hơn các t lệ khác: pic của các parapen cân xứng tuy nhiên còn hơi kéo đuôi, thời gian rửa giải đối với metyl parapen là 3.7 và propyl parapen là 5.1 ph t.
Kết luận: Lựa chọn dung môi pha động ACN - H2O (67 : 33) để tiếp tục điều chỉnh các yếu tố khác.
Để tăng thời gian rửa giải đồng thời làm cho pic không còn kéo đuôi, tiến hành giảm tốc độ dòng từ 1ml/ph t xuống còn 0.9ml/ph t. Kết quả thể hiện ở hình 3.3
Hình 3.3. Sắc ký đồ h n hợp chuẩn parapen ở các tốc độ dòng: a 1ml/ph t ; b 0.9ml/ph t.
Nhận xét: Từ sắc ký đồ trên cho thấy tốc độ dòng 0.9ml/ph t: pic của các
parapen cân xứng, thời gian rửa giải đối với metyl parapen là 4.17 và propyl parapen là 5.69 ph t và khoảng cách giữa các píc phù hợp, thời gian phân tích khoảng 8 ph t.
Kết luận: Lựa chọn hệ dung môi pha động ACN - H2O (67 : 33) và tốc độ dòng 0.9ml/ph t để phân tích các parapen trên nền mẫu.
3.1.2. ết quả khảo sát bước sóng
Khảo sát tại các bƣớc sóng 210nm, 225nm, 254nm, 280nm cho thấy ở bƣớc sóng 254nm sắc ký đồ của mẫu chuẩn cho tín hiệu diện tích đỉnh của các parapen cao nhất. Chọn bƣớc sóng 254 làm bƣớc sóng phân tích mẫu.
Hình 3.4. Sắc ký đồ h n hợp chuẩn ở các bƣớc sóng 210nm, 225nm, 254nm, 280nm
Điều kiện sắc ký tối ƣu đƣợc chọn để định lƣợng đồng thời methylparaben và propylparaben trong rƣợu vang:
Hệ thống máy HPLC THERMO-DIONEX
Pha tĩnh: Cột Phenomemenex Gemini RP-C18 (250mm x 4,6mm x 5µm) Pha động: ACN – nƣớc (67 : 33)
Tốc độ dòng: 0.9 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. Nhiệt độ phòng.
+ Detector UV đặt ở bƣớc sóng 254 nm. Thời gian phân tích 8 ph t
3.2. ết quả khảo sát xử lý mẫu
Dùng phƣơng pháp pha loãng đơn giản: H t 1ml mẫu rƣợu vang bằng pipet chính xác cho vào bình định mức 50ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0.45m trƣớc khi tiêm vào hệ thống HPLC.
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu thử pha loãng 50 lần
Nhận xét: Từ sắc ký đồ của mẫu thử pha loãng 50 lần cho thấy tại thời gian
lƣu của các pic parapen đối với metylparapen là 4.17 và propyl parapen là 5.69 ph t không xuất hiện các pic tạp.
Kết luận: Có thể xử lý mẫu bằng phƣơng pháp pha loãng đơn giản.
3.2. Kết quả thẩm ịnh quy trình ịnh lƣợng ồng thời methylparaben và propylparaben trong rƣợu vang bằng phƣơng pháp UPLC/UV
3.2.1. Tình tương thích hệ thống
Tiêm 6 lần liên tiếp mẫu thử giả lập vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.1.
Hình 3.6. Sắc ký tƣơng thích hệ thống trên mẫu thử thêm chuẩn Bảng 3.1. Kết quả tính tƣơng thích hệ thống trên mẫu thử thêm chuẩn
Th ng số sắc ký Methylparaben Propylparaben
TB SD RSD% TB SD RSD%
Thời gian lƣu ph t 4.169 0,020 0,47 5.676 0,027 0,47
Diện tích đỉnh (mAU) 17.7444 0,232 1.31 14.7820 0.179 1.21
Hệ số bất đối As 1.39 1.29
Độ phân giải Rs 6.32 5.86
Nhận xét: Từ bảng kết quả cho thấy RSD của thông số thời gian lƣu và
diện tích đỉnh của methylparaben < 2 (0.47/1.31); RSD thông số thời gian lƣu và diện tích đỉnh của propylparaben < 2 (0.47/1.21)
Bên cạnh đó, giá trị As của các pic trên sắc ký đồ trong khoảng 0,8 đến 1,5; giá trị Rs > 1,5; N > 2000.
Kết luận: Quy trình phân tích đạt tính tƣơng thích hệ thống trên mẫu thử
thêm chuẩn.
3.2.2. Độ đặc hiệu
Kết quả tính đặc hiệu của quy trình phân tích đƣợc trình bày ở hình 3.7.
Hình 3.7. Sắc ký đồ tính đặc hiệu của quy trình phân tích: (a) Dung môi pha động; (b) Dung môi pha mẫu; c Mẫu thử; (d) Mẫu thử thêm chuẩn; (e) H n
hợp chuẩn.
Nhận xét:
- Trên sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động không xuất hiện pic có thời gian lƣu tƣơng ứng với pic của các paraben trên sắc ký đồ mẫu chuẩn.
- Trên sắc ký đồ mẫu thử, không xuất hiện pic có thời gian lƣu tƣơng ứng với pic của các paraben trên sắc ký đồ mẫu chuẩn
- Trên sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn xuất hiện pic methylparaben, propylparaben có thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của nó trong mẫu chuẩn đơn và mẫu h n hợp chuẩn.
Kết luận: Quy trình phân tích có tính đặc hiệu.
3.2.3. Tính tuyến tính
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng với 5 nồng độ các chuẩn methylparaben và propylparaben lần lƣợt là 0.5ppm, 1ppm, 2ppm, 4ppm, 8ppm, 16ppm, 32ppm và 50ppm. Kết quả tính tuyến tính đƣợc trình bày ở bảng 3.2, hình 3.10 và bảng 3.3, hình 3.12.
Hình 3.9. Sắc ký đồ tính tuyến tính của metylparapen
Hình 3.10. Đồ thị tính tuyến tính của metylparapen Bảng 3.2. Bảng phân tích tuyến tính của metylparapen
Ftn = 49701.85 > F (0.05,1,6) = 5.99 ta = 222.93 > t (0.05,6) = 2.44 tb = 2.48 > t (0.05,6) = 2.44 Phƣơng trình tuyến tính y = 1.3087x + 0.3195 R2 0.9999
Nhận xét : Sử dụng test F và T để kiểm tra cho thấy phƣơng trình tuyến
tính của Metylparapen có tính tƣơng quan chặt chẽ, hệ số a và hệ số b của phƣơng trình đều có ý nghĩa.
Hình 3.11. Sắc ký đồ tính tuyến tính của propylparapen
Bảng 3.3. Bảng phân tích tuyến tính của propylparapen Ftn = 11458.22 > F (0.05,1,6) = 5.99 ta = 107.17 > t (0.05,6) = 2.44 tb = -0.1537 < t (0.05,6) = 2.44 Phƣơng trình tuyến tính y = 1.0802x - 0.0341 R2 0.9995
Nhận xét : Sử dụng test F và T để kiểm tra cho thấy phƣơng trình tuyến
tính của propylparapen có tính tƣơng quan chặt chẽ, hệ số a của phƣơng trình có ý nghĩa và hệ số b của phƣơng trình không có ý nghĩa.
Kết luận :
- Trong khoảng nồng độ 0.5 - 50ppm thì diện tích pic và nồng độ của metylparapen và propylparapen có tính tƣơng quan chặt chẽ với hệ số tƣơng quan R2 lần lƣợt là 0.9999 Metylparapen) và 0.9995 (Propylparapen).
- Phƣơng trình hồi quy của metylparapen đƣợc biểu diễn là : y = 1.3087x + 0.3195
- Phƣơng trình hồi quy của propylparapen đƣợc biểu diễn là : y = 1.0802x - 0.0341
3.2.4. Độ chính xác trong ngày
Kết quả phân tích 6 mẫu thử thêm chuẩn đƣợc tiến hành trong ngày đƣợc thể hiện ở hình 3.13, hình 3.14 và bảng 3.8.
Hình 3.13. Sắc ký đồ độ chính xác của metylparapen
Bảng 3.4. Kết quả độ chính xác trong ngày của quy trình phân tích Mẫu thử Methylparaben Propylparaben Thời gian lƣu Diện tích ỉnh Thời gian lƣu Diện tích ỉnh 1 4,227 19.0298 5,760 15.9380 2 4,233 18.6814 5,760 15.6230 3 4,233 191176 5,760 15.8686 4 4,227 18.9081 5,760 15.7388 5 4,220 18.7957 5,747 15.6765 6 4,220 19.0536 5,740 15.6097 TB 4,227 18.9310 5,754 15.7424 SD 0.006 0.1678 0.009 0.1345 RSD 0.14 0,89 0,002 0,85
Nhận xét: Phƣơng pháp có độ chính xác theo AOAC-mức hàm lƣợng 10 – 100PPM , độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của thời gian lƣu và diện tích pic metylparapen và propylparapen có giá trị không vƣợt quá 7.3% (Metylparapen: 0.14%/0.89; Propylparapen: 0.002%/0.85).
3.3.5. Độ đ ng
3.3.5.1. Metylparapen
Hình 3.15. Sắc ký đồ độ đ ng của metylparapen (80%)
Hình 3.17. Sắc ký đồ độ đ ng của metylparapen (120%)
Bảng 3.5. Kết quả thẩm định độ đ ng của quy trình phân tích metyl parapen
Hoạt chất Lƣợng thêm vào (ppm) Diện tích píc Lƣợng tìm thấy (ppm) Tỉ lệ thu hồi ( % ) Yêu cầu Kết luận Metyl parapen 12.8 14.4480 10.80 84.40 80% – 110% Đạt 14.4079 10.77 84.16 14.5040 10.85 84.73 RSD% (n = 3) 0.34% < 7.3% Đạt 16 18.2334 13.70 85.61 80% – 110% Đạt 18.0843 13.58 84.90 17.4050 13.06 81.65 RSD% (n = 3) 2.51% < 7.3% Đạt 19.2 22.5491 17.00 88.53 80% – 110% Đạt 22.4612 16.93 88.18
22.4041 16.89 87.95
RSD% (n = 3) 0.32% < 7.3% Đạt RSD% (n = 9) 2.64% < 7.3% Đạt
Nhận xét: Phƣơng pháp có đạt độ đ ng theo AOAC- mức nồng độ 10 –
100ppm , độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% của lƣợng metylparapen tìm thấy n = 9 có giá trị không quá 7.3% (2.64 . Lƣợng chất phân tích tìm thấy nằm trong khoảng 80% – 110% ( 81.65% - 88.53%).
3.3.5.2. Propylparapen
Hình 3.19. Sắc ký đồ độ đ ng của propylparapen (100%)
Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ đ ng của quy trình phân tích propyl parapen Hoạt chất Lƣợng thêm vào (ppm) Diện tích píc Lƣợng tìm thấy (ppm) Tỉ lệ thu hồi ( % ) Yêu cầu Kết luận Propyl parapen 12.8 12.0419 11.18 87.34 80% – 110% Đạt 11.9879 11.13 86.95 11.9783 11.12 86.88 RSD% (n = 3) 0.28% < 7.3% Đạt 16 15.1667 14.07 87.95 80% – 110% Đạt 15.0444 13.96 87.24 14.8304 13.76 86.01 RSD% (n = 3) 0.13% < 15% Đạt 19.2 18.5153 17.17 89.44 80% – 110% Đạt 18.4789 17.14 89.26 18.4506 17.11 89.13 RSD% (n = 3) 0.17% < 15% Đạt RSD% (n = 9) 1.39% < 15% Đạt
Nhận xét: Phƣơng pháp có đạt độ đ ng theo AOAC- mức nồng độ 10 –
100ppm , độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của lƣợng propylparapen tìm thấy n = 9 có giá trị không quá 7.3% (1.39 . Lƣợng chất phân tích tìm thấy nằm trong khoảng 80% – 110% ( 86.00% - 89.44%).
Kết luận: Phƣơng pháp có đạt độ đ ng theo AOAC- mức nồng độ 10 –
100ppm) với độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của diện tich pic metylparapen và propylparapen có giá trị không quá 7.3 . Lƣợng chất phân tích tìm thấy nằm trong khoảng 80 – 110%.
3.3.6. iới h n phát hiện và giới h n định lượng 3.3.6.1. Metylparapen
- Giới hạn phát hiện (LOD):
Hình 3.21. Sắc ký đồ giới hạn phát hiện LOD của metylparapen
Nhận xét: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nồng độ 0.008ppm có xuất hiện
pic của metylparapen cao hơn nhiễu đƣờng nền nhiều lần > 3 lần , tuy nhiên hình dạng pic răng cƣa, không còn cân đối và các thông số sắc ký As, Rs không đạt yêu cầu. Do đó chọn giới hạn phát hiện của phƣơng pháp LOD = 0.016ppm
- Giới hạn định lượng (LOQ):
LOQ = LOD x 3.3 = 0.016ppm x 3.3 = 0.45ppm
- Tính LOD, LOQ d a vào đư ng chuẩn:
Trong đó: σ là độ lệch chuẩn của đáp ứng (Standard Error) S là độ dốc của đƣờng chuẩn
Nhƣ vậy giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng metylparapen của phƣơng pháp phù hợp là : LOD = 0.015ppm; LOD = 0.045ppm
3.3.6.2. Propylparapen
- Giới hạn phát hiện (LOD):
Hình 3.22. Sắc ký đồ giới hạn phát hiện LOD của propylparapen
Nhận xét: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nồng độ 0.016ppm có xuất hiện
pic của propylparapen cao hơn nhiễu đƣờng nền nhiều lần > 3 lần , tuy nhiên hình dạng pic răng cƣa, không còn cân đối và các thông số sắc ký As, Rs nằm ngoài ngƣỡng xác định của thiết bị cho giá trị: n.a. . Do đó có giới hạn phát
hiện của phƣơng pháp LOD = 0.03125ppm
- Giới hạn định lượng (LOQ):
LOQ = LOD x 3.3 = 0.03125ppm x 3.3 = 0.1ppm
- Tính LOD, LOQ d a vào đư ng chuẩn:
Trong đó: σ là độ lệch chuẩn của đáp ứng (Standard Error) S là độ dốc của đƣờng chuẩn
Nhƣ vậy giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng propylparapen của phƣơng pháp phù hợp là : LOD = 0.03ppm; LOD = 0.1ppm
Kết luận: Từ kết quả thực nghiệm và khảo sát bằng đƣờng chuẩn, xác định
đƣợc giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp phù hợp là: - Metylparapen: LOD = 0.015ppm; LOD = 0.045ppm
- Propylparapen: LOD = 0.03ppm; LOD = 0.1ppm
3.3. Kết quả ứng dụng quy trình ịnh lƣợng ã thẩm ịnh trên một số mẫu rƣợu vang
Quy trình định lƣợng sau khi thẩm định đạt yêu cầu theo quy định đƣợc áp dụng phân tích 3 mẫu rƣợu vang thu thập trên thị trƣờng TP.Cần Thơ. Kết quả kiểm tra đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả phân tích methylparaben và propylparaben trong một số mẫu rƣợu vang thu thập trên thị trƣờng TP.Cần Thơ
STT Mã sản phẩm
Chất bảo quản tìm thấy
Giới hạn chất bảo quản (mg/kg)
1 R1 Không tìm thấy
1000
2 R2 Không tìm thấy
3 R3 Không tìm thấy
Hình 3.23. Chồng phổ sắc ký đồ của 03 mẫu thử và h n hợp chuẩn
Nhận xét: Trong 03 mẫu rƣợu vang lấy trên thị trƣờng không có chứa chất
Chƣơng 4: BÀN LUẬN
Kết quả khảo sát iều kiện sắc ký
Qua nghiên cứu tài liệu từ những nghiện cứu trƣớc, thấy rằng hệ pha động